Содержание

Уточнение оскорбления чувств верующих

Законопроектом предлагается изменить диспозицию ч.1 ст. 148 УК РФ «Нарушение права на свободу совести и вероисповеданий», уточнив, что публичные действия, выражающие явное неуважение к обществу и совершенные в целях оскорбления религиозных чувств верующих, должны наказываться, если совершены «во время и в местах проведения религиозных обрядов, собраний и церемоний».

Необходимость внесения изменений обоснована тем, что, исходя из положений Конституции РФ, каждый имеет право свободно распространять в том числе атеистические, антиклерикальные и антирелигиозные убеждения, если при этом он не совершает действий, нарушающих общественный порядок и выражающих явное неуважение к обществу, и не посягает на права и свободы других.

По мнению автора поправок, публичные действия могут иметь целью оскорбление религиозных чувств верующих только в том случае, если они препятствуют деятельности религиозных организаций или проведению богослужений, других религиозных обрядов и церемоний. «Более широкое толкование оскорбления религиозных чувств верующих как правонарушения явно посягает на свободу слова и свободу передачи, производства и распространения информации», — говорится в пояснительной записке.

Адвокат АП г. Москвы Юрий Ершов положительно отнесся к самой идее законопроекта: «Поправка нацелена на определенное сглаживание перекоса в «защите чувств», сложившегося после введения уголовной ответственности «за оскорбление чувств верующих». Почему именно чувства верующих защищаются от оскорбления, а чувства остальных – нет, без термина «дискриминация» объяснить непросто».

 

Он добавил, что сам по себе состав ч.1 ст. 148 УК РФ относится к тем позициям, которые отданы на откуп экспертам: следователь назначает экспертизу, получает позитивный ответ и отправляет дело в суд. «Это усиливает и без того практически ничем не ограниченную вакханалию откровенно ангажированных «экспертиз», даже близко не претендующих на объективность и научность, без какой-то методологии, которые строчат в последние годы сервильные эксперты по делам об экстремизме, и по другим «оценочным» составам, — пояснил Юрий Ершов. – Получается, что приговор исходит от эксперта, а суд просто цитирует его и добавляет, что «не видит повода для сомнений», так как эксперт предупрежден об уголовной ответственности. Если попробовать привлечь такого эксперта к ответственности за заведомо ложное заключение (такие случаи бывали), то следствие, как правило, отвечает, что суд экспертизу проверил, так как сослался на нее в судебном акте. И раз он не усмотрел там криминала, то его уже и нет, и это вообще преюдиция».

В этой связи, по мнению Юрия Ершова, любая конкретика в составе – обстоятельства времени и места – весьма важна, так как на них привлекаемые эксперты «пока еще не научились с легкостью влиять».

 

Вместе с тем, он обратил внимание на то, что законопроект требует юридико-технической доработки, поскольку в исходном виде поправка влечет наложение на норму ч.2 ст. 148 УК РФ. «В целом это можно было бы соединить в одну часть, в предлагаемой редакции, исключив вторую часть совсем, так как она будет покрываться первой», — считает Юрий Ершов.

Адвокат АП Московской области, управляющий партнер АБ «АВЕКС ЮСТ» Игорь Бушманов, напротив, считает, что законопроект имеет популистский характер и заранее непроходной: «Он фактически предлагает декриминализировать ч. 1 ст.148 УК РФ, оставив в качестве наказуемой только вторую часть. Однако действие данного уголовного закона направлено на защиту неопределенного числа граждан, интересы которых могут быть затронуты публичными оскорбляющими их чувства действиями, в любом пространстве и форме, а не только произведенными в религиозных «присутственных» местах».

При этом Игорь Бушманов отметил, что деяния, направленные на оскорбления религиозных святынь и чувств верующих («святотатство», «богохульство», «кощунство»),  достаточно строго наказывались по дореволюционным Уложениям о наказаниях уголовных и исправительных – до 15 лет каторжных работ. «Примечательно, что первая защита, которая была поручена в 1892 г. В.И.Ульянову (Ленину), в то время только получившему статус помощника присяжного поверенного, была именно по уголовному делу о «богохульстве». Однако дело достаточно благополучно завершилось для его подзащитного (один год отбывания наказания в тюрьме)», — напомнил адвокат.

 

В целом, по мнению Игоря Бушманова, сегодняшняя практика осуждения по «религиозным» статьям (148, 282 УК РФ) свидетельствует о достаточно мягких видах применяемых судами наказаний – в основном в форме штрафа или обязательных работ. «Хотя надо отметить, что зачастую имеет место быть неправильная квалификация действий, но это уже проблема правильного правоприменения», — заключил он.

Уголовная ответственность за нарушение права на свободу вероисповедания в Российской Федерации как светском государстве

24 апреля 2020

Уголовная ответственность за нарушение права на свободу вероисповедания в Российской Федерации как светском государстве

 

Российская Федерация признается светским государством. Никакая религия не может устанавливается в качестве обязательной или государственной, а религиозные объединения равны перед законом и отделены от государства.

Характер светского государства предполагает свободу совести и свободу вероисповедания. В России данные права устанавливаются и охраняются Конституцией, Федеральным законом «О свободе совести и о религиозных объединениях», а также другими нормативно правовыми актами, принимаемыми в соответствии с ними. Как раз одним из таких нормативно правовых актов является Уголовный кодекс РФ. Ранее уголовный кодекс РФ устанавливал ответственность за «незаконное воспрепятствование деятельности религиозных организаций или совершению религиозных обрядов», но в 2013 году данная норма законодателем была пересмотрена и изложена в новой редакции, согласно которой уголовная ответственность теперь установлена не только за незаконное воспрепятствование деятельности религиозных организаций, но и за «публичные действия, выражающие явное неуважение к обществу и совершенные в целях оскорбления религиозных чувств верующих», а ранее действующая норма стала одним из нескольких предусмотренных ст. 148 УК РФ квалифицирующих составов.

Несмотря на то, что данные изменения были внесены уже более пяти лет назад, вопрос о целесообразности таких изменений по настоящее время является дискуссионным, так как законодательные пробелы при разработке данных изменений не позволяют выработать устойчивую правоприменительную практику данной нормы. Стоит так же отметить, что если основываться на результатах опроса граждан проведенного Всероссийский центром изучения общественного мнения, по итогам которого 82 % из 1600 опрошенных одобрительно отнеслись к ужесточению наказания за оскорбление чувств верующих, то можно говорить о том, что данная новелла в уголовном законодательстве в была воспринята гражданами в общем одобрительно, но в свою очередь, так же нашлись те, кто отнеслись к этому нововведению с критикой.

Конечно не стоит отрицать то, что нормы, устанавливающие ответственность за оскорбление чувств верующих, являются необходимым инструментом защиты гарантированных Конституцией прав человека на свободу совести и свободу вероисповеданий, но одновременно с этим стоит заметить, что замечания, высказываемые в адрес новой редакции статьи 148 УК РФ вовсе не безосновательны, поскольку при ее разработке законодатель допустил некоторые законотворческие ошибки.

Во-первых, одним из основополагающих принципов на основе которых закон должен разрабатываться, толковаться и применяться является принцип правовой определённости. В юридической науке выделяют несколько основных требований которые необходимо соблюдать, основываясь на принципе правовой определенности, как раз одним из таких требований и является «Однозначность, точность, четкость официального толкования отдельных норм и нормативных правовых актов». Исходя из этого можно говорить, что согласно данному принципу, то что не поддается определению не должно регулироваться правовыми нормами.

Применимо к ст. 148 УК РФ, можно выделить несколько понятий, законодательная неопределенность которых может стать причиной не обоснованного уголовного преследования, и незаконного привлечения к уголовной ответственности. Такими понятиями являются «верующий», «чувства верующих». В философии и ряде других неюридических дисциплин эти понятия так же часто определяются по-разному: Согласно Ожегову «верующий — это тот (та), кто признает существование бога; религиозный человек». Словарь Даля вовсе не содержит определения «верующий», но определяет слово «вера» как: «уверенность, убеждение, твердое сознание, понятие о чем-либо, особенно о предметах высших, невещественных, духовных». Исходя из определения «вера» данного в словаре Даля, можно попытаться определить «верующего» как: человека уверенного, убежденного в чем-либо, в том числе в высших и духовных предметах. Отсутствие единого принятого определения «верующий» в прочем, как и других понятий, содержащихся в данной норме, порождает ряд вопросов, например, достаточно ли самого факта веры в конкретного или абстрактного бога, для того чтобы признать человека верующим? Или верующий человек обязательно должен быть еще и религиозным? Как уже указывалось ранее, согласно словарю Ожегова «верующий» — религиозный человек — тот, кто живет в соответствии догмами и предписаниями конкретной религии, совершает определённые религиозные обряды. Как известно, многие признающие себя верующими зачастую не являются религиозными, а просто следуют религиозным предписаниям в силу воспитания влияния общественности или привычек.

Что же касается определения понятия «чувства верующих», то сперва видится необходимым для определения данного понятия определить, что вообще есть «чувства», в советском философском словаре «чувства» определяются как: особый вид эмоциональных переживаний, носящих отчётливо выраженный предметный характер и отличающихся сравнительной устойчивостью. В педагогическом энциклопедическом словаре «чувства» определяются как: высшая форма эмоционального отношения человека к предметам и явлениям действительности, отличающаяся относительной устойчивостью, обобщённостью, соответствием потребностям и ценностям, сформированным в его личностном развитии. Проанализировав данные понятия, можно сказать, что набор чувств у всех людей (как верующих, так и не верующих) одинаков. Религиозные чувства есть ничто иное как обычные чувства, которые верующие испытывают по отношению к тому, что связано с исповедуемой верой.

Во-вторых, как было отмечено в самом начале, Российская Федерация признает себя светским государством. Для того, чтобы признать государство в полной мере светским, оно должно соответствовать ряду основных признаков, в науке выделятся достаточно широкий круг признаков светского государства. На наш взгляд можно выделить группу основных признаков, которые в той или иной мере находят свое отражение в большинстве предложений разных ученных, в эту группу можно включить такие признаки как: Отделение религиозных объединений от государства; Запрет на установления какой-либо религии в качестве государственной, обязательной или официальной; Равенство всех религиозных объединений перед законом; Запрет на осуществление религиозными организациями политической деятельности; Равенство каждого человека и гражданина в независимости от его вероисповедания или иных религиозных убеждений. Последний принцип в рамках данной темы хотелось бы рассмотреть более подробно.

По мнению некоторых авторов, на современном этапе в российском законодательстве принимаются меры, направленные на охрану прав верующих, игнорируя при этом права лиц, которые придерживаются агностических или атеистических взглядов и убеждений, тем самым государство навязывает гражданам религии, в силу того, что верующие находятся под более надежной правовой защитой. В действительности с данным фактом трудно не согласиться. В Федеральном законе «О свободе совести и о религиозных объединениях» говорится, что в России признается право каждого на свободу вероисповедания, равенство перед законом независимо от отношения к религии и убеждений, и что каждый вправе распространять религиозные и иные убеждения и действовать в соответствии с ними. Также данном федеральном законе содержится положение, которое не допускает установление преимуществ, ограничений или иных форм дискриминации в зависимости от отношения к религии. Но в то же время анализ части 1 ст. 148 УК РФ позволяет говорить об обратном, поскольку в диспозиции статьи говорится только о оскорблении чувств исключительно верующих. По нашему мнению, игнорирование чувств неверующих — придерживающихся атеистических антиклерикальных или антирелигиозных убеждений как раз является своеобразной формой дискриминации по признаку отношения к религии, поэтому в целях равной защиты как верующих, так и атеистов либо агностиков, целесообразно расширить диспозицию ч. 1 ст. 148 УК РФ.

Подводя итог, хотелось бы отметить следующие: Безусловно защита конституционно закрепленных прав верующих является важной составляющей жизнедеятельности российского общества, но статья 148 уголовного кодекса, как правовой инструмент такой защиты, требует тщательного усовершенствования и доработки в части законодательного определения содержащихся в ней понятий и соблюдения принципа равенства каждого человека и гражданина в независимости от его вероисповедания или иных религиозных убеждений как одного из основных принципов светского государства коим признает себя Российская Федерация.

В этой связи видится необходимым расширить диспозицию ч.1 ст. 148 УК РФ. поставив тем самым под защиту не только чувства верующих, но и чувства неверующих — придерживающихся атеистических антиклерикальных или антирелигиозных убеждений. Добавить примечания к статье в которых бы определялись понятия: «верующий», «чувства верующих», «оскорбление чувств верующих» которые в свою очередь позволят выработать точную и единообразную практику применения данной нормы.

 

 

 

СПЧ предложит убрать из Уголовного кодекса статью за оскорбление верующих :: Политика :: РБК

Необходимо «сузить легальное определение экстремистской деятельности», поскольку некоторые содержащиеся в нем конструкции — такие как «разжигание социальной розни» и «утверждение религиозного превосходства» — невозможно трактовать однозначно, считают в СПЧ.

Обязательным квалифицирующим признаком экстремизма следует считать насилие, полагают в СПЧ: «В таком случае будет исключена возможность уголовного наказания за высказывания, не представляющие реальной угрозы защищаемым Конституцией РФ интересам». При этом совет предлагает оставить в УК наказание за угрозу экстремистским насилием, призывы к нему и его поддержку.

Читайте на РБК Pro

Совет предлагает исключить из текста статьи формулировку «принадлежности к какой-либо социальной группе»: «Это понятие содержит правовую неопределенность и порождает в правоприменительной практике такие спорные «социальные группы», как «атомщики», «ватники», «депутаты Госдумы», — говорится в документе. Также, по мнению СПЧ, следует убрать формулировку «унижение достоинства», поскольку она «на практике сопоставима с оскорблением, которое является административным правонарушением».

Ч. 1 ст. 20.3 КоАП совет предлагает отредактировать так, чтобы под него не подпадала демонстрация нацистской или экстремистской символики без цели пропаганды.

Еще один состав, который совет предлагает вывести из УК — ч. 1 ст. 148 УК РФ (публичные действия, выражающие явное неуважение к обществу и совершенные в целях оскорбления религиозных чувств верующих). Вместо этого СПЧ предлагает дополнить Кодекс об административных правонарушениях ​отягощенным составом оскорбления. Совет отмечает «правовую неопределенность» терминов «религиозные взгляды» и «верующие» — из законодательства непонятно, можно ли распространять их на атеистические взгляды и, если нет, является ли это дискриминацией атеистов.

Упразднение списка

Федеральный список экстремистских материалов «не оправдал возложенных на него надежд по профилактике экстремизма, а, напротив, стал крайне громоздким и мало пригодным для применения законопослушными гражданами», говорится в проекте рекомендаций. Этот список СПЧ предлагает упразднить. При этом правоохранительные органы могут продолжать «вести служебные реестры материалов, признанных экстремистскими в судебном порядке», считают в совете.

Еще одна рекомендация связана с изменением правил исчисления срока давности преступлений и правонарушений, связанных с высказываниями. Сейчас в УК преступления, связанные с экстремистскими публикациями, рассматриваются как длящиеся, а КоАП исчисляет срок давности с момента фиксации правонарушения, даже если публикация была сделана за несколько лет до него. СПЧ предлагает отсчитывать давность с момента публикации.

С заявлениями о запрете материалов должна централизованно работать Генпрокуратура, а не местные прокуратуры, считают в СПЧ. Судебные заседания о запрете материалов и признании организаций экстремистскими должны проходить строго в присутствии ответчика и в открытых заседаниях, говорится в рекомендациях. Также совет предлагает изменить подследственность дел о публичных призывах к экстремизму и сепаратизму (ст. 280 и 280.1 УК): сейчас ими занимается ФСБ; в СПЧ предлагают передать эти дела Следственному комитету.

Последняя рекомендация касается включения обвиняемых в экстремизме в черный список Росфинмониторинга: включенные туда люди не могут совершать никаких банковских операций. Сейчас обвиняемые по делам об экстремистских высказываниях фактически приравнены к лицам, финансирующим терроризм. В законодательстве их следует дифференцировать, считают в совете.

Рост высказываний и снижение насилия

Совет проанализировал практику по уголовным делам об экстремизме, основываясь на данных судебного департамента Верховного суда, а также материалах информационно-аналитического центра «Сова» и международной правозащитной группы «Агора», говорится в предисловии к рекомендациям. Во многих делах этой категории (особенно связанных с распространением текстов и картинок в соцсетях) имеет место «избыточно широкое, а иногда и ошибочное толкование норм права», пишут авторы рекомендаций.

Экстремистские преступления чаще всего наказываются по ст. 282 УК (разжигание ненависти либо вражды). При этом число осужденных по первой части этой статьи, где речь идет о публичном возбуждении ненависти или унижении достоинства «по признакам пола, расы, национальности, языка, происхождения, отношения к религии, а равно принадлежности к какой-либо социальной группе», год от года растет, следует из статистики, проанализированной СПЧ. В 2011 году по ней осудили 82 человека, в 2014-м — 258, а в 2017-м — 460. Напротив, число осужденных по второй части этой статьи, которая подразумевает насилие, невелико в общей массе и год от года падает: в 2011 году — 35 человек, в 2015-м — девять, в 2017-м — один.

В июне в Госдуму был внесен законопроект, который предлагает переквалифицировать деяния по ч. 1 ст. 282 УК РФ в административное правонарушение, а также смягчить наказание за них. Верховный суд это предложение раскритиковал, но в Минкомсвязи его поддержали.

В середине августа Следственный комитет предъявил обвинение пенсионерке Любови Кузаевой из Тольятти по десяти эпизодам пяти статей УК РФ за посты в соцсети «ВКонтакте». До этого самым известным арестованным за публикации в соцсетях был инженер из Твери Андрей Бубеев, которого в 2016 году приговорили к двум годам и трем месяцам лишения свободы за репост и публикацию картинки о присоединении Крыма в социальной сети «ВКонтакте».

Авторы

Евгения Кузнецова, Маргарита Алехина

Госдуме предложили уточнить закон об оскорблении чувств верующих :: Политика :: РБК

Депутат от КПРФ Олег Смолин внес в Госдуму законопроект, направленный на уточнение рамок действия закона об оскорблении чувств верующих. Как следует из текста документа, размещенного в электронной системе Госдумы (pdf*), наказывать предлагается только за нарушения, допущенные «во время и в местах проведения религиозных обрядов, собраний и церемоний».

Как подчеркивает Смолин в пояснительной записке, эта инициатива направлена на защиту «установленных Конституцией Российской Федерации гарантий свободы мысли и слова».

«Каждый имеет право свободно распространять в том числе атеистические, антиклерикальные и антирелигиозные убеждения, если при этом он не совершает действий, нарушающих общественный порядок и выражающих явное неуважение к обществу, и не посягает на права и свободы других», — говорится в документе.

При этом, по мнению Смолина, сейчас закон об оскорблении чувств верующих недостаточно четко определяет, «каким образом может быть нарушено право на свободу совести и вероисповедания путем оскорбления религиозных чувств верующих». Как отмечает депутат, широкое толкование этого закона «явно посягает на свободу слова и свободу передачи, производства и распространения информации».

Для того, чтобы избежать этого, Смолин предложил ограничить действие ч.1 ст. 148 Уголовного кодекса. Согласно поправке, действия, оскорбляющие чувства верующих, признаются правонарушением только тогда, когда они совершены «во время и в местах проведения религиозных обрядов, собраний и церемоний».

Почему защите чувств верующих не место в Уголовном кодексе / / Независимая газета

Отстаивать идеологические позиции с применением законодательства – это признак слабости




Фото сайта bashkortostan.er.ru


Нынешний состав ч. 1 и 2 ст. 148 УК, известных как «статья о защите религиозных чувств верующих», появился в 2013 году после непривычно долгой для нашего законотворчества дискуссии. Началась она после «дела Pussy Riot», когда стало ясно, что юридическая квалификация их дела никуда не годится. Статью будто конструировали задним числом под этот эпизод. Очевидные с самого начала дефекты законопроекта вызвали необычно сильное сопротивление, затянули его принятие и позволили убрать хотя бы некоторые его пороки. Но сделать нормальную статью Уголовного кодекса не получилось все равно – вышел гибрид хулиганства по мотиву религиозной вражды (элемент из ст. 213) и унижения достоинства верующих (элемент из ст. 282) – и правоприменение оказалось далее не лучше. Критикуют его уже не только секуляристы, но и некоторые религиозные деятели.


Защитники статьи обычно говорят, что подобные и даже более суровые нормы есть в кодексах ряда европейских стран. Это верно, но верно и то, что в Европе эти нормы в последние десятилетия отмирают на глазах. Так что, если уж ссылаться на Европу, непонятно, почему мы должны идти против течения. Лучше посмотреть на более содержательные аргументы сторонников криминализации «оскорбления религиозных чувств».


Важный аргумент, используемый, кстати, не только в России: лучше криминализовать действия тех, кто провоцирует погромы со стороны оскорбленных верующих, чем потом иметь дело с погромами. Обычно на это отвечали, что не стоит выставлять верующих легко манипулируемыми идиотами, но это слабый ответ – увы, легко манипулируемых идиотов хватает в любой группе населения. Поэтому общество может пойти на криминализацию каких-то действий, не столь ужасных самих по себе, из соображений поддержания общественного порядка. Но общество также должно очень серьезно соотнести риски, связанные с угрозой последнему, и ущерб основным свободам человека, а речь идет именно о них. Возможно, общества, находящиеся в ситуации реальной угрозы, например, межрелигиозных столкновений, могут сделать (и часто делают) выбор в пользу безопасности. Но современная Россия очень далека от такого рода угроз. У нас есть религиозно мотивированные террористы, но не было ни разу беспорядков, устроенных именно возмущенными верующими или атеистами; у нас есть (и раньше было гораздо больше) насильственные преступления на почве этнической вражды, но таких же преступлений на почве вражды религиозной были всегда единичные случаи. И потому в нашем случае нет существенных оснований дополнительно ограничивать основные свободы ради безопасности. Тем более что ограничений такого рода у нас и так более чем достаточно.


Иногда приходится слышать, что религиозные чувства гораздо важнее, чем иные чувства. Или даже так – для верующих людей сакральные предметы дороже жизни. Конечно, для кого-то это так и есть. Но закон не может подстроиться под все эмоциональные особенности тех или иных групп граждан, а речь идет все-таки не о большом проценте людей, верящих в Бога, а о малой их части, кому именно такие эмоциональные особенности присущи. Конечно, либеральное общество идет навстречу тем или иным меньшинствам, но ведь не на уровне Уголовного кодекса, то есть не ценой жесткого ограничения прав других.


На этапе принятия того законопроекта звучал также аргумент, что новая норма защитит религиозные меньшинства от диффамации и просто от грубых выпадов. Судя по наблюдениям центра «Сова», повышения толерантности в отношении религиозных меньшинств мы с тех пор не увидели. А уж если посмотреть на практику правоприменения по ч. 1 и 2 ст. 148 УК, то случаи, которые можно было бы расценивать именно как защиту меньшинств, найти не так просто. Можно, конечно, считать меньшинством людей религиозных как таковых, но этот аргумент увел бы нас в настолько запутанную дискуссию, что к ней уж точно не стоит применять столь грубый инструмент, как Уголовный кодекс.


Наконец, сторонники обсуждаемой нормы могут признавать, что некоторые приговоры по ней совсем неуместны или просто нелепы, но настаивают, что надо же как-то защищаться от тех, кто не просто репостит картинки, а совершает какие-то более существенные и криминальные, по сути, действия, именно направленные против религии или верующих. Такие преступления на самом деле редки, но случаются. Представим, что некая антиправославная группа вторглась в храм не с целью сплясать, что является разве что мелким хулиганством, а с намерением порушить иконостас и исписать его оскорбительными надписями. Эти действия вполне соответствуют составу ст. 148, и они явно криминальны, по крайней мере в глазах подавляющего большинства граждан. Но для наказания в этом случае вовсе не нужна отдельная статья УК, такие действия вполне описываются старыми составами о вандализме, хулиганстве или нанесении ущерба имуществу. Важно также, что это преступление при наличии необходимых доказательств может быть квалифицировано как совершенное по мотиву религиозной вражды, и это отягчающее обстоятельство применимо к любым преступлениям (см. п. «е» ч. 1 ст. 63 УК).


Итак, статья о «чувствах верующих» была придумана, чтобы заткнуть замеченную дыру в уголовном законе. Но дыры этой, по сути, нет: для инцидентов типа акции Pussy Riot все равно нужны другие, не уголовные, меры реагирования, а для действительно криминальных действий инструменты в УК есть и так.


И тут нельзя не сказать, что у нового состава УК была и идеологическая составляющая. О ней много написано, и она, очевидно, все еще важна. Но каковы бы ни были планы властей по использованию идеологических аргументов, что бы ни думать о содержании самих этих аргументов, стоит сказать, что конкретный инструмент в виде обновленной ст. 148 УК работает из рук вон плохо, порождая анекдотические – хотя не для самих обвиняемых – дела. Да и вообще защищать идеологические позиции с применением УК – это крайняя мера, признак слабости, прибегать к ней не стоит.

Статья 148 [УПК РФ] — последняя редакция

Статья 148. Отказ в возбуждении уголовного дела

1. При отсутствии основания для возбуждения уголовного дела руководитель следственного органа, следователь, орган дознания или дознаватель выносит постановление об отказе в возбуждении уголовного дела. Отказ в возбуждении уголовного дела по основанию, предусмотренному пунктом 2 части первой статьи 24 настоящего Кодекса, допускается лишь в отношении конкретного лица.

1.1. Решение об отказе в возбуждении уголовного дела в связи с мотивированным постановлением прокурора о направлении соответствующих материалов в орган предварительного следствия для решения вопроса об уголовном преследовании по фактам выявленных прокурором нарушений уголовного законодательства, вынесенное на основании пункта 2 части второй статьи 37 настоящего Кодекса, может быть принято только с согласия руководителя следственного органа.

2. При вынесении постановления об отказе в возбуждении уголовного дела по результатам проверки сообщения о преступлении, связанного с подозрением в его совершении конкретного лица или лиц, руководитель следственного органа, следователь, орган дознания обязаны рассмотреть вопрос о возбуждении уголовного дела за заведомо ложный донос в отношении лица, заявившего или распространившего ложное сообщение о преступлении.

3. Информация об отказе в возбуждении уголовного дела по результатам проверки сообщения о преступлении, распространенного средством массовой информации, подлежит обязательному опубликованию.

4. Копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в течение 24 часов с момента его вынесения направляется заявителю и прокурору. При этом заявителю разъясняются его право обжаловать данное постановление и порядок обжалования.

4.1. По уголовным делам о преступлениях, предусмотренных статьями 198 — 199.4 Уголовного кодекса Российской Федерации, копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в течение 24 часов с момента его вынесения направляется в налоговый орган или территориальный орган страховщика, направившие в соответствии с законодательством Российской Федерации о налогах и сборах и (или) законодательством Российской Федерации об обязательном социальном страховании от несчастных случаев на производстве и профессиональных заболеваний материалы для принятия решения о возбуждении уголовного дела.

5. Отказ в возбуждении уголовного дела может быть обжалован прокурору, руководителю следственного органа или в суд в порядке, установленном статьями 124 и 125 настоящего Кодекса.

6. Признав постановление органа дознания, дознавателя об отказе в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, прокурор отменяет его и направляет соответствующее постановление начальнику органа дознания со своими указаниями, устанавливая срок их исполнения. Признав отказ руководителя следственного органа, следователя в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, прокурор в срок не позднее 5 суток с момента получения материалов проверки сообщения о преступлении отменяет постановление об отказе в возбуждении уголовного дела, о чем выносит мотивированное постановление с изложением конкретных обстоятельств, подлежащих дополнительной проверке, которое вместе с указанными материалами незамедлительно направляет руководителю следственного органа. Признав отказ руководителя следственного органа, следователя в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, соответствующий руководитель следственного органа отменяет его и возбуждает уголовное дело либо направляет материалы для дополнительной проверки со своими указаниями, устанавливая срок их исполнения.

7. Признав отказ в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, судья выносит соответствующее постановление, направляет его для исполнения руководителю следственного органа или начальнику органа дознания и уведомляет об этом заявителя.

последние изменения и поправки, судебная практика

СТ 148 УПК РФ

1. При отсутствии основания для возбуждения уголовного дела руководитель следственного органа, следователь, орган дознания или дознаватель выносит постановление об отказе в возбуждении уголовного дела. Отказ в возбуждении уголовного дела по основанию, предусмотренному пунктом 2 части первой статьи 24 настоящего Кодекса, допускается лишь в отношении конкретного лица.

1.1. Решение об отказе в возбуждении уголовного дела в связи с мотивированным постановлением прокурора о направлении соответствующих материалов в орган предварительного следствия для решения вопроса об уголовном преследовании по фактам выявленных прокурором нарушений уголовного законодательства, вынесенное на основании пункта 2 части второй статьи 37 настоящего Кодекса, может быть принято только с согласия руководителя следственного органа.

2. При вынесении постановления об отказе в возбуждении уголовного дела по результатам проверки сообщения о преступлении, связанного с подозрением в его совершении конкретного лица или лиц, руководитель следственного органа, следователь, орган дознания обязаны рассмотреть вопрос о возбуждении уголовного дела за заведомо ложный донос в отношении лица, заявившего или распространившего ложное сообщение о преступлении.

3. Информация об отказе в возбуждении уголовного дела по результатам проверки сообщения о преступлении, распространенного средством массовой информации, подлежит обязательному опубликованию.

Бесплатная юридическая консультация по телефонам:

4. Копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в течение 24 часов с момента его вынесения направляется заявителю и прокурору. При этом заявителю разъясняются его право обжаловать данное постановление и порядок обжалования.

4.1. По уголовным делам о преступлениях, предусмотренных статьями 198 — 199. 4 Уголовного кодекса Российской Федерации, копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в течение 24 часов с момента его вынесения направляется в налоговый орган или территориальный орган страховщика, направившие в соответствии с законодательством Российской Федерации о налогах и сборах и (или) законодательством Российской Федерации об обязательном социальном страховании от несчастных случаев на производстве и профессиональных заболеваний материалы для принятия решения о возбуждении уголовного дела.

5. Отказ в возбуждении уголовного дела может быть обжалован прокурору, руководителю следственного органа или в суд в порядке, установленном статьями 124 и 125 настоящего Кодекса.

6. Признав постановление органа дознания, дознавателя об отказе в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, прокурор отменяет его и направляет соответствующее постановление начальнику органа дознания со своими указаниями, устанавливая срок их исполнения. Признав отказ руководителя следственного органа, следователя в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, прокурор в срок не позднее 5 суток с момента получения материалов проверки сообщения о преступлении отменяет постановление об отказе в возбуждении уголовного дела, о чем выносит мотивированное постановление с изложением конкретных обстоятельств, подлежащих дополнительной проверке, которое вместе с указанными материалами незамедлительно направляет руководителю следственного органа. Признав отказ руководителя следственного органа, следователя в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, соответствующий руководитель следственного органа отменяет его и возбуждает уголовное дело либо направляет материалы для дополнительной проверки со своими указаниями, устанавливая срок их исполнения.

7. Признав отказ в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, судья выносит соответствующее постановление, направляет его для исполнения руководителю следственного органа или начальнику органа дознания и уведомляет об этом заявителя.

Комментарий к Статье 148 Уголовно-процессуального кодекса

1. По итогам рассмотрения сообщения о преступлении в возбуждении уголовного дела может быть отказано, если будет установлено отсутствие основания для возбуждения уголовного дела. Поскольку основанием для возбуждения уголовного дела служит наличие достаточных данных, указывающих на признаки преступления, то, как правило, отсутствие таких сведений влечет отказ в возбуждении уголовного дела. Из сообщения о преступлении, из материалов проверки сообщения о преступлении может не усматриваться утвердительный ответ о наличии всех признаков преступления. Но эти признаки во всяком случае не должны исключаться на основании имеющихся данных. В то же время как раз обоснованное исключение признаков (признака) преступления является основанием для отказа в возбуждении уголовного дела. Исключение факта существования признака преступления должно быть бесспорным (например, отсутствие события преступления, отсутствие признаков субъекта преступления). Если на этот счет возникают сомнения, они должны быть устранены следственным путем. Например, из материалов проверки неясно, какой ущерб причинен преступлением, и имеющимися данными невозможно мотивировать вывод о малозначительности содеянного.

2. Основания к отказу в возбуждении уголовного дела предусмотрены ст. 24 УПК РФ. К ним относятся:

— отсутствие события преступления. Событие преступления — это действие или бездействие, поэтому данное основание означает, что самого действия или бездействия, обладающего общественной опасностью, не было. Например, заявитель сообщил о краже драгоценностей, а затем выяснилось, что они обнаружились у него. Заявление о краже было сделано таким образом ввиду заблуждения лица о месте нахождения указанных предметов и их похищении кем-либо;

— отсутствие в деянии состава преступления. В данном случае определенное событие имело место, известно лицо, его совершившее, однако отсутствует хотя бы один из элементов состава преступления — объект преступления, субъект преступления, объективная или субъективная сторона преступления. Отказ в возбуждении уголовного дела по данному основанию возможен только в отношении конкретного лица, так как судить о наличии состава преступления возможно применительно к содеянному определенным лицом. Например, в ходе проверки сообщения о краже выяснилось, что сумма похищенного охватывается признаками административного правонарушения, а не преступления;

— истечение сроков давности уголовного преследования. Сроки давности установлены ст. 78 УК РФ и составляют два года, шесть лет, десять лет и пятнадцать лет в зависимости от соответствующих четырех категорий преступлений. Исчисляются сроки давности по каждому преступлению отдельно с момента его совершения преступления. Необходимо учитывать, что вопрос о применении сроков давности к лицу, совершившему преступление, наказуемое смертной казнью или пожизненным лишением свободы, решается судом, поэтому отказ в возбуждении уголовного дела в данном случае недопустим <1>. К лицам, совершившим преступления, предусмотренные ст. ст. 353, 356, 357 и 358 УК РФ, сроки давности не применяются;
———————————
<1> См.: Жалоба лица на постановление об отказе в возбуждении уголовного дела ввиду истечения сроков давности уголовного преследования оставлена судом без удовлетворения // БВС РФ. 2006. N 11.

— смерть подозреваемого или обвиняемого, за исключением случаев, когда производство по уголовному делу необходимо для реабилитации умершего. Буквальное толкование закона не позволяет утверждать, что возможен отказ в возбуждении уголовного дела по данному основанию, поскольку обвиняемый и подозреваемый могут появиться как процессуальные фигуры только после возбуждения уголовного дела. Поэтому применительно к данному основанию уместно вести речь о смерти лица, совершившего общественно опасное деяние, содержащее признаки преступления. Постановлением Конституционного Суда РФ взаимосвязанные положения п. 4 ч. 1 ст. 24 и п. 1 ст. 254 УПК РФ, закрепляющие в качестве основания прекращения уголовного дела смерть подозреваемого (обвиняемого), за исключением случаев, когда производство по уголовному делу необходимо для реабилитации умершего, признаны не соответствующими Конституции РФ в той мере, в какой эти положения в системе действующего правового регулирования позволяют прекратить уголовное дело в связи со смертью подозреваемого (обвиняемого) без согласия его близких родственников <1>;
———————————
<1> См.: Постановление Конституционного Суда РФ от 14 июля 2011 г. N 16-П «По делу о проверке конституционности положений пункта 4 части первой статьи 24 и пункта 1 статьи 254 УПК РФ в связи с жалобами граждан С.И. Александрина и Ю.Ф. Ващенко» // РГ. 2011. 29 июля.

— отсутствие заявления потерпевшего, если уголовное дело может быть возбуждено не иначе как по его заявлению, за исключением случаев, предусмотренных ч. 4 ст. 20 УПК. В данном случае действуют правила об особенностях возбуждения уголовного дела частного и частно-публичного обвинения;

— отсутствие заключения суда о наличии признаков преступления в действиях одного из лиц, указанных в п. п. 2 и 2.1 ч. 1 ст. 448 УПК, либо отсутствие согласия соответственно Совета Федерации, Государственной Думы Федерального Собрания РФ, Конституционного Суда РФ, квалификационной коллегии судей на возбуждение уголовного дела в отношении одного из лиц, указанных в п. п. 1, 3 — 5 ч. 1 ст. 448 УПК. Особенности производства в отношении лиц, указанных в ст. 447 УПК, будут рассмотрены в соответствующей главе учебника;

— отсутствие согласия или заявления о возбуждении уголовного дела со стороны руководителя организации, указанной в ст. 23 УПК, при совершении преступления против интересов исключительно данной организации.

3. Наличие неотмененного постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в отношении гражданина является препятствием для осуществления уголовного преследования этого же лица по одним и тем же фактам <1>.
———————————
<1> См.: Определение СК по УД ВС РФ от 7 августа 2013 г. по делу Б. // БВС РФ. 2014. N 2.

4. Решение об отказе в возбуждении уголовного дела и его мотивы руководителем следственного органа, следователем, органом дознания, дознавателем излагаются в постановлении. Постановление должно быть законным, обоснованным и мотивированным <1>.
———————————
<1> См. по этому поводу: Постановление Президиума ВС Республики Башкортостан по жалобе гражданина Улямаева на постановление об отказе в возбуждении уголовного дела // БВС РФ. 2005. N 5. С. 31.

Гарантии законности и обоснованности решений на этапе возбуждении уголовного дела содержатся в подзаконных актах <1>.
———————————
<1> См. , например, по этому поводу: Приказ Генпрокуратуры РФ, МВД РФ, ФСБ РФ, СК РФ, ФСКН, ФТС, ФСИН, МО РФ, ФССП, МЧС РФ от 26 марта 2014 г. N 147/209/187/23/119/596/149/196/110/154 «Об усилении прокурорского надзора и ведомственного контроля за законностью процессуальных действий и принимаемых решений об отказе в возбуждении уголовного дела при разрешении сообщений о преступлениях» // РГ. 2014. 13 авг.

5. Постановление дознавателя утверждает начальник органа дознания. Решение следователя утверждения со стороны руководителя следственного органа не требует. В то же время следует заметить, что в соответствии с ч. 1.1 ст. 148 УПК РФ решение об отказе в возбуждении уголовного дела в связи с постановлением прокурора о направлении соответствующих материалов в орган предварительного следствия для решения вопроса об уголовном преследовании может быть принято только с согласия руководителя следственного органа.

6. Копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела в течение 24 часов направляется прокурору. Прокурор или его заместитель в 24 часа с момента поступления материалов в прокуратуру рассматривают их и дают оценку законности принятого решения. В случае согласия с постановлением прокурор или его заместитель утверждают своей подписью постановление об отказе в возбуждении уголовного дела.

7. В случае незаконности или необоснованности отказа в возбуждении уголовного дела принимается решение в соответствии с ч. 6 ст. 148 УПК РФ — отменяется решение органа расследования о возбуждении уголовного дела. При этом прокурор в пятидневный срок в адрес руководителя следственного органа или следователя направляет мотивированное постановление, где отмечается, какие обстоятельства требуют дополнительной проверки.

8. Начальнику органа дознания с постановлением об отмене решения об отказе в возбуждении уголовного дела прокурор направляет указания, устанавливая срок их исполнения.

9. Отменяя постановление руководителя следственного органа или следователя об отказе в возбуждении уголовного дела, вышестоящий руководитель следственного органа возбуждает уголовное дело либо направляет материалы для дополнительной проверки со своими указаниями, устанавливая срок их исполнения.

10. Отказывая в возбуждении уголовного дела, если подозревалось в его совершении конкретное лицо, следователь, орган дознания, дознаватель обязаны разрешить вопрос с возбуждением уголовного дела в отношении тех, кто делал заявление о совершении преступления данным лицом или распространял ложное сообщение о преступлении. Распространение заведомо ложного сообщения о преступлении может осуществляться через органы печати, иные средства массовой информации, а также иным доступным для неопределенного круга лиц способом (через Интернет; перед значительным количеством публики и т.п.). При отказе в возбуждении уголовного дела должностное лицо, принимающее решение об этом, обязано направить соответствующее уведомление в средство массовой информации. Средства массовой информации, публиковавшие информацию о преступлении, обязаны поместить в соответствующих изданиях сообщение об отказе в возбуждении уголовного дела в целях реабилитации гражданина. Проверка факта о возможном заведомо ложном доносе проводится по общим правилам проверки сообщений о преступлениях. При наличии признаков преступления, предусмотренного ст. 306 УК РФ, полномочные должностные лица возбуждают уголовное дело. В ходе проверки необходимо убедиться как в наличии признаков заведомо ложного доноса, так и в том, что заявивший о преступлении предупреждался об уголовной ответственности по ст. 306 УК РФ и данное действие отражено в материалах проверки сделанного сообщения о преступлении.

11. При отказе в возбуждении уголовного дела должны быть обеспечены права заинтересованных лиц. С этой целью в 24 часа после вынесения решения копия постановления об отказе в возбуждении уголовного дела направляется заявителю о преступлении. Ему же разъясняется право обжалования постановления руководителю следственного органа, прокурору или в суд по месту принятия решения (о порядке проверки жалоб руководителем следственного органа, прокурором и судом см. ст. ст. 124 и 125 УПК).

12. С жалобой на законность и обоснованность отказа в возбуждении уголовного дела к судье, прокурору или руководителю следственного органа могут обратиться не только заявители, но и другие лица, интересы которых затрагиваются постановлением об отказе в возбуждении уголовного дела <1>.
———————————
<1> См. по этому поводу: Определение Конституционного Суда РФ от 22 января 2004 г. N 119 «По жалобе гражданки Семеновой Лилии Михайловны на нарушение ее конституционных прав частью четвертой статьи 354 Уголовно-процессуального кодекса Российской Федерации» // СЗ РФ. 2004. N 23.

13. Решения руководителя следственного органа и прокурора по жалобам заинтересованных лиц отличаются от решения судьи, что объясняется различием выполняемых ими функций в уголовном процессе. Так, прокурор, руководитель следственного органа и судья вправе оставить жалобу без удовлетворения. Но при обоснованности жалобы прокурор и руководитель следственного органа действуют в пределах предоставленных им полномочий и могут оперативно принимать меры по устранению нарушений. Судья же при обоснованности жалобы вправе вынести постановление о признании решения незаконным или необоснованным, указав одновременно на обязанность соответствующего должностного лица устранить допущенное нарушение. Судья, удовлетворяя жалобу, обязывает соответствующее должностное лицо в пределах его полномочий устранить нарушение закона. В частности, признав отказ в возбуждении уголовного дела незаконным или необоснованным, судья выносит постановление и направляет его для исполнения руководителю следственного органа или начальнику органа дознания с извещением об этом заявителя. Копию вынесенного постановления судья направляет прокурору или руководителю следственного органа, а также заявителю.

14. При отказе в возбуждении уголовного дела могут быть установлены признаки административного, дисциплинарного правонарушения. В этом случае дознаватель, следователь обязаны направить копию постановления об отказе в возбуждении уголовного дела и необходимые материалы органу или должностному лицу, полномочным привлекать к указанным видам ответственности, для принятия решения по существу.

26 Кодекс США § 148 — Арбитраж | Кодекс США | Закон США

, статьи с поправкой на инфляцию для определенных лет

Информацию о корректировке на инфляцию некоторых статей в этом разделе см. В разделе Процедуры получения доходов, перечисленные в таблице в разделе 1 этого заголовка.

Поправки

2017 — Подраздел. (f) (4) (C) (xiv) — (xvii). Паб. Л. 115–97 переименован в цл. (xv) — (xvii) как (xiv) — (xvi), соответственно, и вычеркнуты бывшие п. (xiv). До внесения изменений текст п. (xiv) гласит следующее: «Для целей данного подпункта окончание первоначального временного периода определяется без учета статьи 149 (d) (3) (A) (iv).”

2006 — Подраздел. (f) (4) (D) (ii) (II) — (IV). Паб. Л. 109–222 подкл. (III) и (IV) как (II) и (III), соответственно, и вычеркнуты бывшие подпункты. (II) который гласит следующее: «все облигации, выпущенные государственной единицей для предоставления займов другим правительственным единицам с общими налоговыми полномочиями, не подчиненными такой единице, должны, для целей применения такого подпункта к такой единице, рассматриваться как не выпущенные такой блок ».

2005 — Подраздел. (б) (4). Паб. Л. 109–58 доп. П. (4).

2001 — пп. (f) (4) (D) (vii). Паб. L. 107–16 заменил «меньшее из 10 000 000 долларов» на «меньшее из 5 000 000 долларов».

1997 — п. (c) (2) (B) — (E). Паб. L. 105–34, §1444 (a), подпункты переименованы. (C) — (E) как (B) — (D), соответственно, и вычеркнут заголовок и текст бывшего подпункта. (В). Текст гласит: «В случае, если выручка от выпуска будет использоваться для предоставления или финансирования ссуд в рамках программы, описанной в разделе 144 (b) (1) (A), подпункт (A) применяется путем замены« 18 месяцев »на« 6 месяцев ».Предыдущее предложение не применяется к облигациям, выпущенным после 31 декабря 1988 г. »

Подсек. (г) (3). Паб. L. 105–34, §1443, вычеркнутый абз. (3) что связано с ограничениями на вложения в нецелевые инвестиции.

Подсек. (f) (4) (B) (ii) (I). Паб. L. 105–34, §1441, заменил «5 процентов от выручки от выпуска» на «меньшую из 5 процентов от выручки от выпуска или 100 000 долларов».

Подсек. (f) (4) (C) (xvii). Паб. L. 105–34, §1442, добавлен кл. (xvii).

Подсек.(f) (4) (D) (vii). Паб. L. 105–34, §223 (a), добавлен п. (vii).

Подсек. (f) (4) (E). Паб. L. 105–34, §1444 (b), вычеркнутый подпункт. (E), что связано с исключением для определенных облигаций квалифицированного студенческого кредита.

1990 — п. (c) (2) (D). Паб. L. 101–508, §11701 (j) (5), заменено «подраздел (f) (4) (C) (iv)» на «подраздел (f) (4) (B) (iv) (IV)»). во вводных положениях и «подразделе (f) (4) (C) (v)» вместо «подразделе (f) (4) (B) (iv) (VIII)» в п. (я).

Подсек. (c) (2) (D), (E). Паб.L. 101–508, §11701 (j) (6), внесла техническую поправку в Pub. L. 101–239, §7652 (c). См. Примечание к поправке 1989 г. ниже.

Подсек. (f) (4) (B) (i). Паб. L. 101–508, §11701 (j) (2), в последнем предложении заменено «замещающий фонд и валовая выручка, которые возникают по истечении таких 6 месяцев и которые не были разумно ожидаемыми на дату выпуска, не должны считаться валовыми. выручка только для целей подпункта (I) »для« замещающего фонда не считается валовой выручкой только для целей настоящего подпункта »в заключительных положениях.

Подсек. (f) (4) (B) (i) (II). Паб. L. 101–508, §11701 (j) (1), исправленный пп. (II) в целом. До внесения поправок, подп. (II) гласит следующее: «требования пункта (2) выполняются по истечении таких 6 месяцев в отношении доходов по суммам в любом разумно требуемом резервном или замещающем фонде».

Подсек. (f) (4) (B) (iv). Паб. L. 101–508, §11701 (j) (4), исправленный п. (iv) как правило, замена настоящих положений на положения, которые предусматривали применение специального правила в течение 2-летнего периода для определенных строительных облигаций от выпусков, в которых не менее 75 процентов чистой выручки от выпуска должны были использоваться для строительства расходы в отношении собственности, которая принадлежала государственному учреждению или организации 501 (c) (3).

Подсек. (f) (4) (C) — (E). Паб. L. 101–508, §11701 (j) (3) (A), (B), добавлен подпункт. (C) и переименовали бывшие подпарки. (C) и (D) как (D) и (E) соответственно.

1989 — пп. (c) (2) (D), (E). Паб. L. 101–239, §7652 (c), с поправками, внесенными Pub. L. 101–508, §11701 (j) (6), добавлен подпункт. (D) и переименован в бывшую подпарку. (D) как (E).

Подсек. (d) (3) (E) (ii). Паб. L. 101–239, §7814 (c) (2), вычеркнуто «квалифицированная ипотечная облигация или» после «в случае».

Подсек.(f) (4) (B) (i). Паб. L. 101–239, §7652 (a), с поправками, п. (i) в целом. До внесения изменений п. (i) читать следующим образом: «Для целей данного подраздела выпуск должен рассматриваться как отвечающий требованиям параграфа (2), если валовая выручка от такого выпуска расходуется на правительственные цели, для которых выпуск был выпущен не позднее дня, который составляет 6 месяцев с даты выдачи такого выпуска. Валовая выручка, которая хранится в добросовестном фонде обслуживания долга, не считается валовой выручкой только для целей настоящего подпункта.”

Подсек. (f) (4) (B) (ii) (I). Паб. L. 101–239, §7652 (d), после слова «6 месяцев» добавлено «каждое место, где оно появляется».

Подсек. (f) (4) (B) (iii) (III). Паб. L. 101–239, §7816 (r), заменил «такую ​​дату выпуска или дату» на «такую ​​дату выпуска. или дату ».

Подсек. (f) (4) (B) (iv). Паб. L. 101–239, §7652 (b), добавлен п. (iv).

Подсек. (f) (4) (C) (ii) (II). Паб. L. 101–239, §7816 (t), заменено «предоставлять ссуды» на «от имени».

1988 — пп.(Би 2). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (43) (B), вычеркнутый в конце «Такой термин не включает никаких освобожденных от налогов облигаций».

Подсек. (б) (2) (Д). Паб. L. 100–647, §5053 (b), добавлен подпар. (E).

Подсек. (б) (3). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (43) (A), добавлен п. (3).

Подсек. (г) (2). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (14), заменил «любой резервный или замещающий фонд» на «любой фонд, описанный в параграфе (1)».

Подсек. (е) (1). Паб. L. 100–647, §4005 (d) (2), вычеркнуто «квалифицированная ипотечная облигация или» после «применить к любому».

Подсек. (е) (3). Паб. L. 100–647, §6177 (b), добавлен в конце «В случае облигации с ожидаемым налогом и доходом, последний взнос не требуется делать до даты, которая наступит через 8 месяцев после даты выпуска выпуска. частью которого является облигация ».

Паб. L. 100–647, §1013 (a) (15), добавлен «Ряд выпусков, погашенных в течение 6-месячного периода (или такого более длительного периода, который может быть установлен Секретарем), должен рассматриваться (по выбору эмитента) как 1 выпуск для целей предыдущего предложения, если никакая облигация, которая является частью любого выпуска такой серии, не имеет срока погашения более 270 дней или является облигацией для частной деятельности.”

Подсек. (е) (4) (А). Паб. L. 100–647, §6181 (a), (b), вычеркнуто «если эмитент не выберет иное» перед словами «любая заработанная сумма» в п. (ii) и вставлен в конце подпункта. (A) «В случае выпуска, облигация которого не является облигацией для частной деятельности, пункт (ii) должен применяться без учета долларового ограничения в нем, если средний срок погашения выпуска (определяется в соответствии с разделом 147 (b) ) (2) (A)) составляет не менее 5 лет, и процентные ставки по облигациям, которые являются частью выпуска, не меняются в течение срока выпуска.

Подсек. (f) (4) (B) (iii) (I). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (16) (A), «совокупная номинальная сумма» заменена «выручкой».

Подсек. (f) (4) (B) (iii) (III). Паб. L. 100–647, § 6177 (a), заменено «более ранняя из даты, через 6 месяцев после такой даты выдачи». для «самой ранней из даты погашения выпуска — даты через 6 месяцев после такой даты выпуска».

Подсек. (е) (4) (С). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (17) (A), в заголовке заменено «государственные единицы, выпускающие облигации на сумму 5 000 000 долларов или меньше» на «небольшие государственные единицы», существующее положение обозначено как п.(i), добавлен заголовок «В целом», изменено обозначение существующих пп. (i) — (iv) как подпункты. (I) — (IV) и выровняли их поля, вычеркнув последнее предложение при условии, что п. (iv) не принимать во внимание какие-либо облигации, которые не находятся в обращении на момент более позднего выпуска или которые погашаются, за исключением авансового возмещения, из чистой выручки от более позднего выпуска, и добавленных пп. (ii) — (vi).

Подсек. (f) (4) (C) (i) (IV). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (17) (B), вычеркнуто «(и все его подчиненные подразделения)» после «такое подразделение».

Подсек. (f) (4) (C) (ii). Паб. L. 100–647, §6183 (a), добавлен подп. (II) и переименованы бывшие подкл. (II) и (III) как (III) и (IV) соответственно.

Подсек. (f) (4) (D) (i). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (18), вставлено «для программы» перед «описанным в разделе 144 (b) (1) (A)» во вводном тексте, заменено «такая программа» на «такая программа »в подкл. (I) и вставлен в конце «Суммы, обозначенные как проценты по студенческим ссудам, не должны приниматься во внимание при определении того, возмещены ли эмитенту такие расходы.За исключением случаев, когда иное предусмотрено в правилах, предписанных Секретарем, расходы, описанные в подпункте (I), уплаченные из сумм, заработанных, как описано в первом предложении этого пункта, также могут быть приняты во внимание при определении доходности по студенческим кредитам в рамках описанной программы. в разделе 144 (b) (1) (A) ».

Подсек. (е) (7) (В). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (19), заменено «не по причине» на «по разумной причине, а не по уважительной причине».

Дата вступления в силу поправки 1988 г.

Паб. Л.100–647, раздел I, §1013 (a) (16) (B), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3540, при условии, что:

«Поправка, внесенная в подпункт (A) [поправка к этому разделу], применяется к облигациям, выпущенным после 30 июня 1987 года».

Паб. L. 100–647, раздел I, §1013 (a) (17) (C), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3542, при условии, что:

«(я)
За исключением случаев, предусмотренных в пункте (ii), поправки, внесенные в этот пункт [вносящие поправки в этот раздел], применяются к облигациям, выпущенным после 30 июня 1987 года.

«(Ii)
При избрании эмитента (сделанном в такое время и таким образом, как это может предписать министр финансов или его представитель) поправки, внесенные настоящим параграфом, применяются к такому эмитенту, как если бы они были внесены в поправки, внесенные разделом 1301 ( а) Закона о налоговой реформе 1986 года [поправка к статье 103 этого раздела].

Паб. L. 100–647, раздел I, §1013 (a) (43) (C), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3545, при условии, что:

«Поправки, внесенные в этот параграф [поправки к этому разделу], применяются к обязательствам, выпущенным после 31 марта 1988 года».

Поправка разделом 1013 (a) (14), (15), (18), (19) Pub. L. 100–647 действует, если не предусмотрено иное, как если бы оно было включено в положение Закона о налоговой реформе 1986 г., Pub. L. 99–514, к которому относится такая поправка, см. Раздел 1019 (a) Pub. Л.100–647, изложенные в виде примечания к разделу 1 этого заголовка.

Поправка разделом 4005 (d) (2) Pub. L. 100–647, применимые к выпущенным облигациям и избранным суммам невыпущенных облигаций после 31 декабря 1988 г., см. Раздел 4005 (h) (1) Pub. L. 100–647, изложенная в виде примечания к разделу 143 этого заголовка.

Поправка разделом 5053 (b) Pub. L. 100–647, применимые, за некоторыми исключениями, к обязательствам, выпущенным после 21 октября 1988 г., см. Раздел 5053 (c) Pub. L. 100–647, изложенный в виде примечания к разделу 145 этого заголовка.

Паб. L. 100–647, раздел VI, §6177 (c), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3727, при условии, что:

«Поправки, внесенные в этот раздел [поправки в этот раздел], применяются к облигациям, выпущенным после даты вступления в силу этого Закона [ноябрь. 10, 1988] ».

Паб. L. 100–647, раздел VI, §6181 (c), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3729, при условии, что:

«(1) В целом.
Поправки, внесенные в этот раздел [поправки в этот раздел], применяются к облигациям, выпущенным после даты вступления в силу настоящего Закона [ноябрь.10, 1988].

«(2) Выборы для находящихся в обращении облигаций.
Любой выпуск облигаций, кроме облигаций для частной деятельности, находящихся в обращении на дату вступления в силу настоящего Закона, должен иметь право однократного выбора для применения поправок, внесенных в подпункт (b) [поправка к этому разделу], к суммам, депонированным после такой даты в добросовестные фонды обслуживания долга по таким облигациям.

«(3) Определение обязательства частной деятельности.
Для целей этого раздела и последнего предложения раздела 148 (f) (4) (A) Кодекса 1986 года (как добавлено в подразделе (b)) термин «облигация частной деятельности» включает любые оговоренные 501 (c) (3) залог (как определено в разделе 145 Кодекса 1986 года).”

Паб. L. 100–647, раздел VI, §6183 (b), 10 ноября 1988 г., 102 Stat. 3730, при условии, что:

«Поправка, внесенная в подпункт (а) [поправка к этому разделу], применяется к облигациям, выпущенным после 31 декабря 1988 г.».

ПЕРСОНАЛ

Подраздел A:
ВИДЫ ПЕРСОНАЛА

СТАТЬЯ 17.Виды
Персонал и другие человеческие ресурсы
а. Персонал (также «сотрудники» или «служащие»)
я. Карьерный обслуживающий персонал
II. Персонал по непрерывным контрактам
iii. Персонал на срочных контрактах, финансируемых из регулярного фонда или
Панамериканский фонд Лео С. Роу
iv. Персонал по срочным контрактам, финансируемым из других фондов, кроме
Обычный фонд или Панамериканский фонд Лео С. Роу
v.Доверительный персонал
vi. Секретари, исполнительные секретари и директора
Межамериканский судебный комитет, Межамериканская комиссия по
Правозащитные, специализированные организации и организации, заключившие контракты в
в соответствии со статьей 22 настоящих Общих стандартов
vii. Управленческий персонал
viii. Местный персонал
ix. Младший персонал
б. Прочие человеческие ресурсы
я. Независимые консультанты и подрядчики
II.Стажеры
iii. Волонтеры
iv. Молодые специалисты
c. Финансирование
Статья 18. Карьерный персонал
а. Поэтапный отказ от карьерной службы
б. Особые права служебного персонала
c. Заработная плата и другие льготы
Статья 19. Персонал, назначаемый по бессрочным контрактам
а. Право на участие и назначение
б. Список правомочности
c. Срок действия, прекращение действия и возмещение убытков
d.Мобильность и повторное трудоустройство
е. Пенсионные права
f. Продвижение
грамм. Обучение
час Заработная плата и другие льготы
Статья 20. Персонал, назначаемый по срочным контрактам с финансированием
Регулярным фондом или Панамериканским фондом Лео С. Роу
а. Общие характеристики
б.и. Контракты серии А
II. Контракты серии B
iii. Контракты для специальных миссий (SMC)
c. Заработная плата и другие льготы
d.Пенсионные права
е. Переходное положение
Статья 20 бис. Персонал, назначенный на срочный контракт
Финансируется фондами, отличными от регулярного фонда или фонда Лео С. Роу Пэна
Американский фонд
а. Общие характеристики
б. я. Контракты серии А
II. Контракты для специальных миссий (SMC)
c. Заработная плата и другие льготы
d. Временное положение
Статья 21 Доверительный персонал
а. Выявление доверительных позиций
б. Описание и особые положения
c. Заработная плата и другие льготы
Статья 22. Исполнительные секретари и директора
Межамериканский юридический комитет, Межамериканская комиссия по
Права человека, специализированные учреждения и организации
Статья 23. Должности управленческого персонала
Статья 24. Местный персонал
а. Общее описание
б. Особые положения, заработная плата и льготы
СТАТЬЯ 25.Младший персонал
а. Общее описание
б. Особые положения, заработная плата и другие льготы
Статья 26. Документ о назначении.

Подраздел B:
СТАТУС И ОБЯЗАННОСТИ ВСЕХ ЧЛЕНОВ И ОГРАНИЧЕНИЯ ИХ
ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

Статья 27. Подчинение Генеральному секретарю
СТАТЬЯ 28.Статус международных гражданских служащих
Статья 29. Автономность при исполнении обязанностей
Статья 30. Ограничение деятельности и публичные заявления
Статья 31. Усмотрение
Статья 32. Оказание услуг и получение льгот
Статья 33. Выдвижение на выборную государственную должность
Статья 34. Прием государственного поста
Статья 35. Заявление о лояльности
Статья 36. Влияние и поддержка государства
СТАТЬЯ 37.Привилегии и иммунитеты

Подраздел C:
ЗАРПЛАТА, КЛАССИФИКАЦИЯ И ОЦЕНКА

СТАТЬЯ 38.
Классификация и аудит сообщений
Статья 39. Оценка выполнения работы
Статья 40. Заработная плата

Подраздел D:
НАБОР, ОТБОР И НАЗНАЧЕНИЕ

СТАТЬЯ 41.Основные условия
Статья 42. Гражданство
Статья 43. Медицинское освидетельствование
.
Статья 44. Набор, отбор и назначение
а. Консультативный комитет по отбору и продвижению по службе
б. Публикация и уведомление
c. Проверка квалификации и собеседование
d. Назначения на должности категории общего обслуживания
е. Назначения на должности категории специалистов
f. Назначения на реклассифицированные должности
грамм.Знание языка
час География распространения
я. Пол
j. Исключения из Конкурсного требования
Статья 45. Преимущество при заполнении вакантных должностей
Статья 46. Испытательный срок
Статья 47. Реестр штатных сотрудников

Подраздел E:
ПРЕИМУЩЕСТВА

Статья 48. Отпуск
.
СТАТЬЯ 49.Оставить
Статья 50. Социальное обеспечение
Статья 51. Путевые расходы, расходы на установку и репатриацию
Статья 52. Прочие права и льготы

Подраздел F:
ТРУДОВЫЕ ОТНОШЕНИЯ

Статья 53. Ассоциация персонала и Комитет персонала

Подраздел G:
ДИСЦИПЛИНА, ОТДЕЛЕНИЕ ОТ СЛУЖБЫ, РАЗРЕШЕНИЕ СПОРОВ И
ВОЗМЕЩЕНИЕ

Статья 54. Принятие мер дисциплинарного воздействия
Статья 55. Виды дисциплинарных мер
.
Статья 56. Консультативный комитет по дисциплинарным мерам
Статья 57. Отставание от службы
Статья 58. Извещение
Статья 59. Увольнение без дисциплинарного производства
Статья 60. Отставка
Статья 61. Выходное пособие
Статья 62. Неприменимость положений о возмещении
Статья 63. Корректировка выходного пособия и репатриация
Грант на оплату уже полученных за предыдущее обслуживание
СТАТЬЯ 64.Право на слушание
Статья 65. Право на повторное рассмотрение
Статья 66. Консультативный комитет по пересмотру дела
Статья 67. Апелляция в Административный трибунал

.

ПОДГРУЗКА H:
ОМБУДСПЕРСОН

Статья 68. Омбудсмен
Статья 69. Аппарат Омбудсмена
Статья 70. Отчетность
.
СТАТЬЯ 71.Доступ
Статья 72. Квалификация Омбудсмена
Статья 73. Назначение, продолжительность назначения и снятие с должности
Омбудсмен

Подраздел I:
ПРОЧИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Статья 74. Сфера действия термина «сотрудники»
Статья 75. Применение Общих кадровых норм.
Вопросы
СТАТЬЯ 76.Поправки к Общим стандартам по кадровым вопросам

Congress.gov | Библиотека Конгресса

Секция записи Конгресса

Ежедневный дайджест

Сенат

жилой дом

Расширения замечаний

Замечания участников
Автор: любой член Дома Адамс, Альма С. [D-NC] Адерхольт, Роберт Б. [R-AL] Агилар, Пит [D-CA] Аллен, Рик У. [R-GA] Оллред, Колин З. [D-TX] Амодеи, Марк Э. [R -NV] Армстронг, Келли [R-ND] Аррингтон, Джоди К. [R-TX] Auchincloss, Jake [D-MA] Axne, Cynthia [D-IA] Бабин, Брайан [R-TX] Бэкон, Дон [R -NE] Бэрд, Джеймс Р. [R-IN] Балдерсон, Трой [R-OH] Бэнкс, Джим [R-IN] Барр, Энди [R-KY] Барраган, Нанетт Диас [D-CA] Басс, Карен [ D-CA] Битти, Джойс [D-OH] Бенц, Клифф [R-OR] Бера, Ami [D-CA] Бергман, Джек [R-MI] Бейер, Дональд С., младший [D-VA] Байс , Стефани И. [R-OK] Биггс, Энди [R-AZ] Билиракис, Гас М.[R-FL] Бишоп, Дэн [R-NC] Бишоп, Сэнфорд Д., младший [D-GA] Блуменауэр, Эрл [D-OR] Блант Рочестер, Лиза [D-DE] Боберт, Лорен [R-CO ] Бонамичи, Сюзанна [D-OR] Бост, Майк [R-IL] Bourdeaux, Carolyn [D-GA] Bowman, Jamaal [D-NY] Бойл, Брендан Ф. [D-PA] Брэди, Кевин [R-TX ] Брукс, Мо [R-AL] Браун, Энтони Г. [D-MD] Браунли, Джулия [D-CA] Бьюкенен, Верн [R-FL] Бак, Кен [R-CO] Бакшон, Ларри [R-IN ] Бадд, Тед [R-NC] Берчетт, Тим [R-TN] Берджесс, Майкл К. [R-TX] Буш, Кори [D-MO] Бустос, Cheri [D-IL] Баттерфилд, GK [D-NC ] Калверт, Кен [R-CA] Каммак, Кэт [R-FL] Карбаджал, Салуд О.[D-CA] Карденас, Тони [D-CA] Карл, Джерри Л. [R-AL] Карсон, Андре [D-IN] Картер, Эрл Л. «Бадди» [R-GA] Картер, Джон Р. [ R-TX] Картрайт, Мэтт [D-PA] Кейс, Эд [D-HI] Кастен, Шон [D-IL] Кастор, Кэти [D-FL] Кастро, Хоакин [D-TX] Cawthorn, Мэдисон [R- NC] Шабо, Стив [R-OH] Чейни, Лиз [R-WY] Чу, Джуди [D-CA] Cicilline, Дэвид Н. [D-RI] Кларк, Кэтрин М. [D-MA] Кларк, Иветт Д. . [D-NY] Кливер, Эмануэль [D-MO] Клайн, Бен [R-VA] Клауд, Майкл [R-TX] Клайберн, Джеймс Э. [D-SC] Клайд, Эндрю С. [R-GA] Коэн, Стив [D-TN] Коул, Том [R-OK] Комер, Джеймс [R-KY] Коннолли, Джеральд Э.[D-VA] Купер, Джим [D-TN] Корреа, Дж. Луис [D-CA] Коста, Джим [D-CA] Кортни, Джо [D-CT] Крейг, Энджи [D-MN] Кроуфорд, Эрик А. «Рик» [R-AR] Креншоу, Дэн [R-TX] Крист, Чарли [D-FL] Кроу, Джейсон [D-CO] Куэльяр, Генри [D-TX] Кертис, Джон Р. [R- UT] Дэвидс, Шарис [D-KS] Дэвидсон, Уоррен [R-OH] Дэвис, Дэнни К. [D-IL] Дэвис, Родни [R-IL] Дин, Мадлен [D-PA] ДеФазио, Питер А. [ D-OR] DeGette, Diana [D-CO] DeLauro, Rosa L. [D-CT] DelBene, Suzan K. [D-WA] Delgado, Antonio [D-NY] Demings, Val Butler [D-FL] DeSaulnier , Марк [D-CA] DesJarlais, Scott [R-TN] Deutch, Theodore E.[D-FL] Диас-Баларт, Марио [R-FL] Дингелл, Дебби [D-MI] Доггетт, Ллойд [D-TX] Дональдс, Байрон [R-FL] Дойл, Майкл Ф. [D-PA] Дункан , Джефф [R-SC] Данн, Нил П. [R-FL] Эммер, Том [R-MN] Эскобар, Вероника [D-TX] Эшу, Анна Г. [D-CA] Эспайлат, Адриано [D-NY ] Эстес, Рон [R-KS] Эванс, Дуайт [D-PA] Фэллон, Пэт [R-TX] Feenstra, Рэнди [R-IA] Фергюсон, А. Дрю, IV [R-GA] Фишбах, Мишель [R -MN] Фицджеральд, Скотт [R-WI] Фитцпатрик, Брайан К. [R-PA] Флейшманн, Чарльз Дж. «Чак» [R-TN] Флетчер, Лиззи [D-TX] Фортенберри, Джефф [R-NE] Фостер, Билл [D-IL] Фокс, Вирджиния [R-NC] Франкель, Лоис [D-FL] Франклин, К.Скотт [R-FL] Фадж, Марсия Л. [D-OH] Фулчер, Расс [R-ID] Gaetz, Мэтт [R-FL] Галлахер, Майк [R-WI] Галлего, Рубен [D-AZ] Гараменди, Джон [D-CA] Гарбарино, Эндрю Р. [R-NY] Гарсия, Хесус Дж. «Чуй» [D-IL] Гарсия, Майк [R-CA] Гарсия, Сильвия Р. [D-TX] Гиббс, Боб [R-OH] Хименес, Карлос А. [R-FL] Гомерт, Луи [R-TX] Голден, Джаред Ф. [D-ME] Гомес, Джимми [D-CA] Гонсалес, Тони [R-TX] Гонсалес , Энтони [R-OH] Гонсалес, Висенте [D-TX] Гонсалес-Колон, Дженниффер [R-PR] Гуд, Боб [R-VA] Гуден, Лэнс [R-TX] Госар, Пол А. [R-AZ ] Gottheimer, Джош [D-NJ] Granger, Kay [R-TX] Graves, Garret [R-LA] Graves, Sam [R-MO] Green, Al [D-TX] Green, Mark E.[R-TN] Грин, Марджори Тейлор [R-GA] Гриффит, Х. Морган [R-VA] Гриджалва, Рауль М. [D-AZ] Гротман, Гленн [R-WI] Гость, Майкл [R-MS] Гатри, Бретт [R-KY] Хааланд, Дебра А. [D-NM] Хагедорн, Джим [R-MN] Хардер, Джош [D-CA] Харрис, Энди [R-MD] Харшбаргер, Диана [R-TN] Хартцлер, Вики [R-MO] Гастингс, Элси Л. [D-FL] Хейс, Джахана [D-CT] Херн, Кевин [R-OK] Херрелл, Иветт [R-NM] Эррера Бейтлер, Хайме [R-WA ] Хайс, Джоди Б. [R-GA] Хиггинс, Брайан [D-NY] Хиггинс, Клэй [R-LA] Хилл, Дж. Френч [R-AR] Хаймс, Джеймс А. [D-CT] Хинсон, Эшли [R-IA] Hollingsworth, Trey [R-IN] Horsford, Steven [D-NV] Houlahan, Chrissy [D-PA] Hoyer, Steny H. [D-MD] Хадсон, Ричард [R-NC] Хаффман, Джаред [D-CA] Huizenga, Билл [R-MI] Исса, Даррелл Э. [R-CA] Джексон, Ронни [R-TX] Джексон Ли, Шейла [D-TX] Джейкобс, Крис [R-NY] Джейкобс, Сара [D-CA] Jayapal, Pramila [D-WA] Джеффрис, Хаким С. [D-NY] Джонсон, Билл [R-OH] Джонсон, Дасти [R-SD] Джонсон, Эдди Бернис [D-TX] Джонсон, Генри К. «Хэнк» младший [D-GA] Джонсон, Майк [R-LA] Джонс, Mondaire [D-NY] Джордан, Джим [R-OH] Джойс, Дэвид П. [R-OH] Джойс, Джон [R-PA] Кахеле, Kaiali’i [D-HI] Каптур, Марси [D-OH] Катко, Джон [R-NY] Китинг , Уильям Р.[D-MA] Келлер, Фред [R-PA] Келли, Майк [R-PA] Келли, Робин Л. [D-IL] Келли, Трент [R-MS] Кханна, Ро [D-CA] Килди, Дэниел Т. [D-MI] Килмер, Дерек [D-WA] Ким, Энди [D-NJ] Ким, Янг [R-CA] Kind, Рон [D-WI] Кинзингер, Адам [R-IL] Киркпатрик, Энн [D-AZ] Кришнамурти, Раджа [D-IL] Кустер, Энн М. [D-NH] Кустофф, Дэвид [R-TN] ЛаХуд, Дарин [R-IL] Ламальфа, Дуг [R-CA] Лэмб, Конор [D-PA] Ламборн, Дуг [R-CO] Ланжевен, Джеймс Р. [D-RI] Ларсен, Рик [D-WA] Ларсон, Джон Б. [D-CT] Латта, Роберт Э. [R-OH ] Латернер, Джейк [R-KS] Лоуренс, Бренда Л.[D-MI] Лоусон, Эл, младший [D-FL] Ли, Барбара [D-CA] Ли, Сьюзи [D-NV] Леже Фернандес, Тереза ​​[D-NM] Леско, Дебби [R-AZ] Левин , Энди [зам. С. [D-CA] Лукас, Фрэнк Д. [R-OK] Люткемейер, Блейн [R-MO] Лурия, Элейн Г. [D-VA] Линч, Стивен Ф. [D-MA] Мейс, Нэнси [R -SC] Малиновски, Том [D-NJ] Маллиотакис, Николь [R-NY] Мэлони, Кэролин Б. [D-NY] Мэлони, Шон Патрик [D-NY] Манн, Трейси [R-KS] Мэннинг, Кэти Э. .[D-NC] Мэсси, Томас [R-KY] Маст, Брайан Дж. [R-FL] Мацуи, Дорис О. [D-CA] МакБэт, Люси [D-GA] Маккарти, Кевин [R-CA] МакКол , Майкл Т. [R-TX] Макклейн, Лиза К. [R-MI] МакКлинток, Том [R-CA] МакКоллум, Бетти [D-MN] МакИчин, А. Дональд [D-VA] Макговерн, Джеймс П. [D-MA] МакГенри, Патрик Т. [R-NC] МакКинли, Дэвид Б. [R-WV] МакМоррис Роджерс, Кэти [R-WA] Макнерни, Джерри [D-CA] Микс, Грегори В. [D- Нью-Йорк] Мейер, Питер [R-MI] Мэн, Грейс [D-NY] Meuser, Daniel [R-PA] Mfume, Kweisi [D-MD] Миллер, Кэрол Д. [R-WV] Миллер, Мэри Э. [ R-IL] Миллер-Микс, Марианнетт [R-IA] Мооленаар, Джон Р. [R-MI] Муни, Александр X. [R-WV] Мур, Барри [R-AL] Мур, Блейк Д. [R-UT] Мур, Гвен [D-WI] Морелл, Джозеф Д. [D-NY ] Моултон, Сет [D-MA] Мрван, Фрэнк Дж. [D-IN] Маллин, Маркуэйн [R-OK] Мерфи, Грегори [R-NC] Мерфи, Стефани Н. [D-FL] Надлер, Джерролд [D -NY] Наполитано, Грейс Ф. [D-CA] Нил, Ричард Э. [D-MA] Негусе, Джо [D-CO] Нелс, Трой Э. [R-TX] Ньюхаус, Дэн [R-WA] Ньюман , Мари [D-IL] Норкросс, Дональд [D-NJ] Норман, Ральф [R-SC] Нортон, Элеонора Холмс [D-DC] Нуньес, Девин [R-CA] О’Халлеран, Том [D-AZ] Обернолте, Джей [R-CA] Окасио-Кортес, Александрия [D-NY] Омар, Ильхан [D-MN] Оуэнс, Берджесс [R-UT] Палаццо, Стивен М.[R-MS] Паллоне, Фрэнк, младший [D-NJ] Палмер, Гэри Дж. [R-AL] Панетта, Джимми [D-CA] Папас, Крис [D-NH] Паскрелл, Билл, мл. [D -NJ] Пейн, Дональд М., младший [D-NJ] Пелоси, Нэнси [D-CA] Пенс, Грег [R-IN] Перлмуттер, Эд [D-CO] Перри, Скотт [R-PA] Питерс, Скотт Х. [D-CA] Пфлюгер, Август [R-TX] Филлипс, Дин [D-MN] Пингри, Челли [D-ME] Пласкетт, Стейси Э. [D-VI] Покан, Марк [D-WI] Портер, Кэти [D-CA] Поузи, Билл [R-FL] Прессли, Аянна [D-MA] Прайс, Дэвид Э. [D-NC] Куигли, Майк [D-IL] Радваген, Аумуа Амата Коулман [R- AS] Раскин, Джейми [D-MD] Рид, Том [R-NY] Решенталер, Гай [R-PA] Райс, Кэтлин М.[D-NY] Райс, Том [R-SC] Ричмонд, Седрик Л. [D-LA] Роджерс, Гарольд [R-KY] Роджерс, Майк Д. [R-AL] Роуз, Джон В. [R-TN ] Розендейл старший, Мэтью М. [R-MT] Росс, Дебора К. [D-NC] Роузер, Дэвид [R-NC] Рой, Чип [R-TX] Ройбал-Аллард, Люсиль [D-CA] Руис , Рауль [D-CA] Рупперсбергер, Калифорния Датч [D-MD] Раш, Бобби Л. [D-IL] Резерфорд, Джон Х. [R-FL] Райан, Тим [D-OH] Саблан, Грегорио Килили Камачо [ D-MP] Салазар, Мария Эльвира [R-FL] Санчес, Линда Т. [D-CA] Сан-Николас, Майкл FQ [D-GU] Сарбейнс, Джон П. [D-MD] Scalise, Steve [R-LA ] Скэнлон, Мэри Гей [D-PA] Шаковски, Дженис Д.[D-IL] Шифф, Адам Б. [D-CA] Шнайдер, Брэдли Скотт [D-IL] Шрейдер, Курт [D-OR] Шриер, Ким [D-WA] Швейкерт, Дэвид [R-AZ] Скотт, Остин [R-GA] Скотт, Дэвид [D-GA] Скотт, Роберт С. «Бобби» [D-VA] Сешнс, Пит [R-TX] Сьюэлл, Терри А. [D-AL] Шерман, Брэд [D -CA] Шерилл, Мики [D-NJ] Симпсон, Майкл К. [R-ID] Sires, Альбио [D-NJ] Slotkin, Элисса [D-MI] Смит, Адам [D-WA] Смит, Адриан [R -NE] Смит, Кристофер Х. [R-NJ] Смит, Джейсон [R-MO] Смакер, Ллойд [R-PA] Сото, Даррен [D-FL] Спанбергер, Эбигейл Дэвис [D-VA] Спарц, Виктория [ R-IN] Шпейер, Джеки [D-CA] Стэнтон, Грег [D-AZ] Стаубер, Пит [R-MN] Стил, Мишель [R-CA] Стефаник, Элиза М.[R-NY] Стейл, Брайан [R-WI] Steube, В. Грегори [R-FL] Стивенс, Хейли М. [D-MI] Стюарт, Крис [R-UT] Стиверс, Стив [R-OH] Стрикленд , Мэрилин [D-WA] Суоззи, Томас Р. [D-NY] Swalwell, Эрик [D-CA] Такано, Марк [D-CA] Тейлор, Ван [R-TX] Тенни, Клаудия [R-NY] Томпсон , Бенни Г. [D-MS] Томпсон, Гленн [R-PA] Томпсон, Майк [D-CA] Тиффани, Томас П. [R-WI] Тиммонс, Уильям Р. IV [R-SC] Титус, Дина [ D-NV] Тлайб, Рашида [D-MI] Тонко, Пол [D-NY] Торрес, Норма Дж. [D-CA] Торрес, Ричи [D-NY] Трахан, Лори [D-MA] Трон, Дэвид Дж. .[D-MD] Тернер, Майкл Р. [R-OH] Андервуд, Лорен [D-IL] Аптон, Фред [R-MI] Валадао, Дэвид Г. [R-CA] Ван Дрю, Джефферсон [R-NJ] Ван Дайн, Бет [R-TX] Варгас, Хуан [D-CA] Визи, Марк А. [D-TX] Вела, Филемон [D-TX] Веласкес, Нидия М. [D-NY] Вагнер, Ann [R -MO] Уолберг, Тим [R-MI] Валорски, Джеки [R-IN] Вальс, Майкл [R-FL] Вассерман Шульц, Дебби [D-FL] Уотерс, Максин [D-CA] Уотсон Коулман, Бонни [D -NJ] Вебер, Рэнди К., старший [R-TX] Вебстер, Дэниел [R-FL] Велч, Питер [D-VT] Венструп, Брэд Р. [R-OH] Вестерман, Брюс [R-AR] Векстон, Дженнифер [D-VA] Уайлд, Сьюзан [D-PA] Уильямс, Nikema [D-GA] Уильямс, Роджер [R-TX] Уилсон, Фредерика С.[D-FL] Уилсон, Джо [R-SC] Виттман, Роберт Дж. [R-VA] Womack, Steve [R-AR] Райт, Рон [R-TX] Ярмут, Джон А. [D-KY] Янг , Дон [R-AK] Зельдин, Ли М. [R-NY] Любой член Сената: Болдуин, Тэмми [D-WI] Баррассо, Джон [R-AK] Беннет, Майкл Ф. [D-CO] Блэкберн, Марша [ R-TN] Блюменталь, Ричард [D-CT] Блант, Рой [R-MO] Букер, Кори А. [D-NJ] Бузман, Джон [R-AR] Браун, Майк [R-IN] Браун, Шеррод [ D-OH] Берр, Ричард [R-NC] Кантуэлл, Мария [D-WA] Капито, Шелли Мур [R-WV] Кардин, Бенджамин Л. [D-MD] Карпер, Томас Р. [D-DE] Кейси , Роберт П., Младший [D-PA] Кэссиди, Билл [R-LA] Коллинз, Сьюзан М. [R-ME] Кунс, Кристофер А. [D-DE] Корнин, Джон [R-TX] Кортез Масто, Кэтрин [D -NV] Коттон, Том [R-AR] Крамер, Кевин [R-ND] Крапо, Майк [R-ID] Круз, Тед [R-TX] Дейнс, Стив [R-MT] Дакворт, Тэмми [D-IL ] Дурбин, Ричард Дж. [D-IL] Эрнст, Джони [R-IA] Файнштейн, Dianne [D-CA] Фишер, Деб [R-NE] Гиллибранд, Кирстен Э. [D-NY] Грэм, Линдси [R -SC] Грассли, Чак [R-IA] Хагерти, Билл [R-TN] Харрис, Камала Д. [D-CA] Хассан, Маргарет Вуд [D-NH] Хоули, Джош [R-MO] Генрих, Мартин [ D-NM] Гикенлупер, Джон В.[D-CO] Hirono, Mazie K. [D-HI] Hoeven, John [R-ND] Hyde-Smith, Cindy [R-MS] Inhofe, James M. [R-OK] Johnson, Ron [R-WI] ] Кейн, Тим [D-VA] Келли, Марк [D-AZ] Кеннеди, Джон [R-LA] Кинг, Ангус С., младший [I-ME] Klobuchar, Amy [D-MN] Ланкфорд, Джеймс [ R-OK] Лихи, Патрик Дж. [D-VT] Ли, Майк [R-UT] Лёффлер, Келли [R-GA] Лухан, Бен Рэй [D-NM] Ламмис, Синтия М. [R-WY] Манчин , Джо, III [D-WV] Марки, Эдвард Дж. [D-MA] Маршалл, Роджер В. [R-KS] МакКоннелл, Митч [R-KY] Менендес, Роберт [D-NJ] Меркли, Джефф [D -ИЛИ] Моран, Джерри [R-KS] Мурковски, Лиза [R-AK] Мерфи, Кристофер [D-CT] Мюррей, Пэтти [D-WA] Оссофф, Джон [D-GA] Падилья, Алекс [D-CA ] Пол, Рэнд [R-KY] Питерс, Гэри К. [D-MI] Портман, Роб [R-OH] Рид, Джек [D-RI] Риш, Джеймс Э. [R-ID] Ромни, Митт [R-UT] Розен, Джеки [D-NV] Раундс, Майк [R-SD] Рубио, Марко [R-FL] Сандерс, Бернард [I-VT] Sasse, Бен [R-NE] Schatz, Брайан [D-HI] Шумер, Чарльз Э. [D-NY] Скотт, Рик [R-FL] Скотт, Тим [R-SC] Шахин, Джин [D-NH] Шелби, Ричард К. [R-AL] Синема, Кирстен [D-AZ] Смит, Тина [D-MN] Стабеноу, Дебби [D-MI] Салливан, Дэн [R-AK] Тестер, Джон [D-MT] Тьюн, Джон [R-SD] Тиллис, Том [R-NC] Туми, Пэт [R-PA] Тубервиль, Томми [R -AL] Ван Холлен, Крис [D-MD] Уорнер, Марк Р.[D-VA] Варнок, Рафаэль Г. [D-GA] Уоррен, Элизабет [D-MA] Уайтхаус, Шелдон [D-RI] Уикер, Роджер Ф. [R-MS] Уайден, Рон [D-OR] Янг , Тодд [R-IN]

Регламент, делегированный Комиссией (ЕС) 2015/2446 Показать полное название

Статья 148U.K. Аннулирование таможенной декларации после выпуска товаров (статья 174 (2) Кодекса)

1. Где установлено, что товары имеют была заявлена ​​ошибочно для таможенной процедуры, при которой возникла таможенная задолженность по импорту вместо декларирования для другой таможенной процедуры, таможенная декларация признается недействительной после выпуска товаров по мотивированному заявлению декларанта, если выполнены следующие условия выполняются:

(a) заявка подается в течение 90 дней с даты принятия декларации;

(b) товары не использовались способом, несовместимым с таможенной процедурой, в соответствии с которой они были бы задекларированы, если бы не произошла ошибка;

(c) на момент ошибочной декларации были выполнены условия для помещения товаров под таможенную процедуру, в соответствии с которой они были бы задекларированы, если бы ошибка не произошла;

(d) подана таможенная декларация для таможенной процедуры, в соответствии с которой товары были бы задекларированы, если бы не произошло ошибки.

2. Если установлено, что товары были задекларированы по ошибке вместо других товаров, для таможенной процедуры, по которой возникла таможенная задолженность по импорту, таможенная декларация признается недействительной после выпуска товаров по обоснованным причинам. заявление декларанта при соблюдении следующих условий:

(a) заявка подается в течение 90 дней с даты принятия декларации;

(b) ошибочно задекларированные товары не использовались иначе, как разрешено в их первоначальном состоянии, и были восстановлены в их первоначальном состоянии;

(c) одна и та же таможня компетентна в отношении ошибочно заявленных товаров и товаров, которые декларант намеревался декларировать;

(d) товары должны быть задекларированы для той же таможенной процедуры, что и ошибочно задекларированные.

3.Если товары, которые были проданы по дистанционному контракту, как определено в Статье 2 (7) Директивы 2011/83 / ЕС Европейского парламента и Совета (), были выпущены в свободное обращение и возвращены, таможенная декларация признается недействительной после выпуска товаров по мотивированному заявлению декларанта при соблюдении следующих условий:

(а) заявка подается в течение 90 дней с даты принятия таможенной декларации;

(b) товары были экспортированы с целью их возврата на адрес исходного поставщика или на другой адрес, указанный этим поставщиком.

4. Помимо случаев, указанных в параграфах 1, 2 и 3, таможенные декларации признаются недействительными после выпуска товаров по мотивированному заявлению декларанта в любом из следующих случаев:

(a) если товары были выпущены для экспорта, реэкспорта или внешней переработки и не покинули таможенную территорию Союза;

(b) если товары Союза были заявлены по ошибке для таможенной процедуры, применимой к товарам, не входящим в Союз, и их таможенный статус в качестве товаров Союза был впоследствии подтвержден с помощью T2L, T2LF или таможенного грузового манифеста;

(c) если товары были ошибочно задекларированы по более чем одной таможенной декларации;

(d) если разрешение с обратной силой выдается в соответствии со статьей 211 (2) Кодекса;

(e), если товары Союза были помещены на процедуру таможенного складирования в соответствии со Статьей 237 (2) Кодекса и больше не могут быть помещены на эту процедуру в соответствии со Статьей 237 (2) Кодекса.

5. Таможенная декларация в отношении товаров, облагаемых экспортной пошлиной, к заявлению о возмещении импортной пошлины, возмещении или других экспортных суммах или других специальных мерах при экспорте может быть признана недействительной только в соответствии с параграфом 4. (а) если выполняются следующие условия:

(a) декларант предоставляет таможне экспорта или, в случае внешней переработки, таможне места размещения доказательства того, что товары не покинули таможенную территорию Союза;

(b) если таможенная декларация составлена ​​на бумажном носителе, декларант возвращает в таможню экспорта или, в случае внешней обработки, таможню места размещения, все копии таможенной декларации вместе с любыми другими документами выдается ему при принятии декларации;

(c) декларант предоставляет экспортной таможне доказательства того, что любые возмещения и другие суммы или финансовые преимущества, предусмотренные при экспорте товаров, о которых идет речь, были возвращены или что компетентные органы приняли необходимые меры для обеспечения что им не платят;

(d) декларант соблюдает любые другие обязательства, которые он связан в отношении товаров;

(e) любые корректировки, внесенные в экспортную лицензию, представленную в поддержку таможенной декларации, аннулируются.

Корреляционная свето-электронная микроскопия выявляет трубчато-мешочную ультраструктуру носителей, действующих между аппаратом Гольджи и плазменной мембраной | Журнал клеточной биологии

Установив общую структуру и динамику GPC, мы хотели определить их морфологию и взаимоотношения с другими органеллами с более высокой степенью детализации, используя тонкие (40-60 нм) срезы. Поскольку наш текущий протокол корреляционной микроскопии не допускает таких срезов, мы прибегли к традиционному протоколу блока 20 ° C с последующей фиксацией и маркировкой иммунопероксидазой в разное время после перехода на 32 ° C.Рис. 6a подтверждает, что, как и ожидалось, белок-груз сохранялся в Golgi при 20 ° C. Интересно, что он присутствовал не только в TGN, но также в медиальных и трансцистернах. Цис-Гольджи, ER и PM не были маркированы. Через 5–10 мин от сдвига до 32 ° C в цитоплазме появились многочисленные объекты, меченные VSVG. Как подробно описано ниже, общий размер и форма этих тел были трубчато-мешковидными, подобными GPC, идентифицированным с помощью корреляционной микроскопии. Поэтому мы предполагаем, что это GPC.Одновременно с образованием GPC, комплекс Гольджи снижал интенсивность метки (фиг. 6b). Однако транс-компоненты стопок оставались окрашенными в течение 30 минут после прогрева (данные не показаны). На отдельных срезах GPC выглядели как длинные канальцы диаметром 50–250 нм (рис. 6, b – f) или как скопления канальцев. GPCs были похожи в клетках независимо от того, подверглись ли они блоку при 20 ° C (рис. 6 c). Также были видны некоторые круглые профили, скорее всего, поперечные сечения канальцев (см. Ниже) и мешковидные структуры (рис.6 г). Потенциально важным наблюдением было то, что часть GPC была тесно связана с эндосомами (данные не показаны). Однако поскольку не было установлено однозначной преемственности между двумя структурами, актуальность таких контактов остается неясной. Некоторые GPCs были локализованы около транс-большей цистерны Гольджи (Рис. 6b и Рис. C). Иногда появлялись окрашенные GPC-подобные тела, связанные с ПМ. На первый взгляд, эти структуры могут быть либо GPC, претерпевающими слияние, как те, что наблюдаются с помощью корреляционной световой ЭМ, либо, альтернативно, эндоцитарными канальцами, содержащими VSVG (рис. 6е и рис. Ж). Однако последний случай можно исключить на основании экспериментов с эндоцитарными маркерами WGA, лектинами AlloA и катионизированным золотом. Когда эти меченые золотом индикаторы были добавлены перед высвобождением из блока 20 ° C, частицы золота были обнаружены на поверхности клеток, в покрытых клатрином пузырьках, некоторых канальцах и мультивезикулярных телах (рис. 6e). Однако они никогда не наблюдались в GPCs или в VSVG-положительных мембранно-связанных канальцах (Fig. 6e). Таким образом, изображения на рис. 6f и рис. G, скорее всего, соответствуют слиянию GPC с PM.Когда для трехмерной реконструкции использовались серийные срезы, многие из GPC, которые появлялись на отдельных срезах в виде канальцев (рис. 7, a – h), оказались на самом деле плоскими, подобными цистерне мешочками (рис. 7i и рис. J). . Однако другие GPC были настоящими канальцами. Чаще всего встречались трубчато-мешковидные формы. Как отмечалось выше, GPCs напоминают трубчато-саккулярные мембраны TGN и иногда располагаются в областях, где TGN имеет так называемый отслаивающийся вид (Ladinsky et al. 1994; Clermont et al. 1995). Таким образом, были необходимы серийные срезы, чтобы определить, принадлежат ли структуры, окрашенные на VSVG, к TGN или отделяют GPC.Окрашенные истинные везикулы (определенные как круглые профили, не обрамленные совпадающими изображениями в двух соседних срезах) практически отсутствовали. Вместо этого можно было увидеть множество неокрашенных пузырьков, окружающих стопки Гольджи (рис. 6c), что, кстати, указывает на то, что наша процедура фиксации сохраняет везикулярные структуры.

Внеклеточный гистон h2 является нейротоксичным и вызывает …

Введение

Все основные неврологические заболевания и травмы центральной и периферической нервной системы несут одни и те же цитопатологические особенности, а именно гибель нейронов и реактивный глиоз.Эти дифференциальные ответы возникают одновременно в одной и той же среде, но почему это происходит, плохо понимается. Дегенерирующая нервная система не является неспецифическим полем смерти.

Наблюдения, описанные здесь, являются результатом экспериментов, разработанных для идентификации аксональных хемопеллентов, в которых эксплантаты дегенерирующего мозга взрослых крыс были совместно культивированы с эксплантатами эмбрионального мозга в матрицах коллагенового геля. Неожиданно мы обнаружили, что мозг взрослого человека вызывает опосредованную диффузией дегенерацию эмбриональных аксонов, и показали, что дегенерирующий мозг взрослого человека высвобождает гистоновые белки.Гистон h2, но не гистоны ядра, избирательно убивает нейроны коркового вещества эмбриона и заставляет клетки микроглии становиться реактивными.

Гистоны — это высокоосновные белки, которые присутствуют в ядре, где они образуют основные компоненты эукариотического хроматина и действуют, регулируя транскрипцию. Коровые гистоны, h3A, h3B, h4 и h5 имеют относительно похожие структуры, содержащие гистоновый складчатый домен, и вместе образуют гистоновый октамер. Обмотка геномной ДНК вокруг этого октамера образует основную единицу упаковки ДНК, называемую нуклеосомой. Члены более дивергентного семейства гистонов h2 / H5 структурно не связаны с коровыми гистонами и функционируют для связывания нуклеосом. Обычно предполагалось, что гистоны ограничены ядром, но все больше данных указывает на то, что гистоны, комплексы гистон-ДНК и пептиды, производные гистонов, имеют цитоплазматические и внеклеточные местоположения и действия 1 .

Ядро и линкерные гистоны и нуклеосомы были обнаружены как на поверхности клетки 2–6 , так и в цитоплазме 7,8 , а также были связаны с апоптозом 7–11 .Несколько линий доказательств подтверждают идею о том, что внеклеточные гистоны могут вносить вклад в механизмы заболеваний человека. Антигистоновые антитела присутствуют при сосудистой деменции и пресенильной болезни Альцгеймера (AD) 12 . При системной красной волчанке (СКВ) высвобождается множество различных ядерных антигенов, которые вызывают высокие титры деструктивных аутоантител против гистонов 8 . Действительно, значительная часть пациентов с СКВ имеет ассоциированную нейродегенерацию. Более свежие данные показывают, что внеклеточные гистоны могут опосредовать гибель эндотелиальных клеток и сепсис 13 и вызывать тромбоцитопению через агрегацию тромбоцитов 14 .

Материалы и методы

Животные

Крысы Sprague Dawley и Wistar были получены из Charles River и содержались в 12-часовом цикле свет-темнота с кормом и питьевой водой ad libitum. Животные были убиты в соответствии с Приложением 1 из-за вывиха шейки матки в соответствии с Правилами Министерства внутренних дел Великобритании. Для культур нейронов кору головного мозга удаляли из эмбрионального дня (E). 15-17 эмбрионов крыс Sprague Dawley и эксплантаты мозга взрослых были получены от матери.

Для микроглиальных культур мать и ее помет содержали в одной клетке, и детенышей постнатального дня 3 (P3) умерщвляли в соответствии с Правилами 1 Министерства внутренних дел Великобритании путем быстрой декапитации.

Для экспериментов с субстратом кортикальные нейроны мышей получали из мышей E16.5 CBA x C57BL / 6 (выращенных в Университете Умео) в соответствии с одобрением, предоставленным Этическим комитетом по экспериментам на животных Университета Умео (номер разрешения: A113-11). Животных содержали как часть племенной колонии в специально отведенном помещении при 12-часовом цикле свет-темнота с кормом и питьевой водой, подаваемыми в неограниченном количестве . Изоляция нейронов была проведена после того, как мать умерла из-за смещения шейки матки (утром была обнаружена вагинальная пробка, как было определено, как E0,5).

Все эксперименты на животных были разработаны и выполнены в соответствии с установленными принципами сокращения, уточнения и замены.

Культура ткани

Кортикальные эксплантаты препарировали на кусочки размером примерно 200–400 мкм 2 (эмбриональные) и 500–1200 мкм 2 (взрослые) с помощью тонких вольфрамовых игл и держали на ледяной минимальной необходимой среде (MEM , Gibco UK). Для диссоциированных культур эмбриональная кора коры также была разрезана на мелкие кусочки и диссоциирована с помощью системы диссоциации папаина (Worthington Biochemicals) в соответствии с инструкциями производителя. Нейроны помещали на покровные стекла диаметром 13 мм, покрытые сначала поли-D-лизином (10 мкг / мл в PBS), а затем ламинином (10 мкг / мл в PBS) (Gibco) и культивировали при 37 ° C в увлажненной 8% -ной среде. CO 2 (об. / Об.) Атмосфера в течение 24–48 часов в нейробазальной среде плюс 1% (об. / Об.) Антибиотик-антимикотик (Gibco).Для приготовления кондиционированной среды мозговые оболочки были удалены из головного мозга взрослых и эмбрионов, а затем были разрезаны на мелкие кусочки (~ 2 мм 3 ) и сохранены на ледяной MEM.

Коллаген получали смешиванием 90 мкл отфильтрованного коллагена крысиного хвоста, как описано в 15 , с 10 мкл 10-кратной концентрации модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM, Gibco), которую хранили на льду до тех пор, пока не потребовалось 15,16 , и устанавливают путем смешивания с 2–3 мкл 7,5% (мас. / об.) бикарбоната натрия (Gibco). Эксплантаты помещали в чашки Falcon диаметром 35 мм, избыточную жидкость отсасывали с помощью тонкой стеклянной капиллярной трубки и покрывали 30 мкл схватывавшегося раствора коллагена.Совместные культуры взрослой и эмбриональной коры головного мозга теперь располагали на расстоянии ~ 0,5–1 мм друг от друга, и при необходимости между ними вводили покрытые лектином агарозные шарики (Vector Laboratories) (1-2 мкл). Совместные культуры и диссоциированные клетки инкубировали в течение 24–48 часов в среде DMEM плюс 1% (мас. / Об.) Антибиотик-антимикотик (Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 8% (об.) CO 2 и исследовали. методом фазово-контрастной микроскопии (программное обеспечение Nikon T800 и Lucia).

Кондиционированную среду для взрослых готовили путем инкубации двух измельченных корковых слоев на 20 мл культуральной среды, в то время как для кондиционированной среды для эмбрионов использовали четыре цельных мозга E15 на мл.Инкубацию выполняли в течение 48 часов, как указано выше, но среду пополняли через 24 часа. Кондиционированные среды центрифугировали в течение 3 минут при 900 g и хранили при -20 ° C. Были проведены тщательные проверки, чтобы убедиться, что pH остается физиологическим.

Очистка белка

Гистоны и другие белки были выделены и идентифицированы из кондиционированных сред взрослых и эмбрионов. Колонки для аффинной хроматографии были сконструированы с использованием шариков агарозы в качестве твердой фазы, с которой был ковалентно связан лектин Sambucus nigra (Vector Laboratories, 3 мг лектина / мл геля).Колонки загружали 5 мл кондиционированной среды и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем промывали 5 мл PBS и элюировали 5 мл PBS и альфа-лактозой (500 мМ), затем 5 мл PBS и 2% (масс. / v) уксусная кислота в соответствии с инструкциями производителя. Элюирование осуществляли под действием силы тяжести (колонка 1 мл) или с помощью насоса (колонка 10 мл, 0,4 мл / мин). Элюаты концентрировали в две стадии, сначала с использованием 5000 НМВЛ (предел номинальной молекулярной массы) 15 мл фильтров (Microcon, Millipore), центрифугировали при 900 g при комнатной температуре до тех пор, пока не осталось 2 мл. Эти аликвоты дополнительно концентрировали с использованием 1,5-мл фильтров NMWL Microcon с пределом номинальной молекулярной массы, центрифугировали при 13000 g при комнатной температуре до высыхания. Материал был восстановлен из мембранных фильтров в 10–40 мл буфера для образцов, изготовленного в соответствии с Laemmli 17 , и хранился при -20 ° C.

Электрофорез в денатурирующем геле (Laemmli) проводили с использованием 10% (мас. / Об.) SDS-полиакриламидных гелей (SDS-PAGE). Перед загрузкой образцы денатурировали, а электрофорез проводили при постоянном токе 25 мА, используя буферную систему Трис-глицин с SDS (192 мМ глицин (Sigma), 25 мМ основание Trizma (Sigma) и 0.1% SDS (Fisher Scientific)). Гели окрашивали R250 кумасси бриллиантовым синим (1 г кумасси в 50% (об. / Об.) Метаноле / 10% (мас. / Об.) Уксусной кислоте) и обесцвечивали 12% (об. / Об.) Метанолом в 7% (мас. / Об.) уксусная кислота в течение 1 минуты. Маркеры молекулярной массы анализировали со всеми гелями. Представляющие интерес полосы вырезали из гелей и хранили при -20 ° C до секвенирования.

Секвенирование

окрашенных Кумасси полос, разделенных с помощью SDS-PAGE, вырезали и расщепляли 200 нг трипсина (Promega) в течение 4 часов при 37 ° C.Полученные пептиды разделяли обращенно-фазовой хроматографией (Vydac C18 0,8 × 150 мм) и анализировали с помощью масс-спектрометрии с лазерной десорбцией / ионизацией с использованием матрицы (MALDI TOF) с использованием анализатора протеомики Applied Biosystems 4700. Пептидные массы искали в неизбыточной базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) с использованием программного обеспечения Protein Prospector MS-FIT (Калифорнийский университет в Сан-Франциско).

Заявка на гистон

Рекомбинантные гистоны человека h2, h3A, h3B, h4 и h5 были получены от New England Biolabs.Кроме того, гистон h2, очищенный из тимуса теленка, и рекомбинантные гистоны h3A, h3B, h4 и h5 Xenopus laevis были получены от Millipore. Гистоны разводили в питательной среде, как указано.

Кортикальные нейроны и анализ люциферазы

Первичные нейроны коры высевали на покрытые поли-D-лизином и ламинином (оба 10 мкг / мл) черные 96-луночные планшеты (Greiner) в количестве 3 x 10 4 клеток на лунку в 100 мкл. Клетки инкубировали в течение 48 часов в нейробазальной среде с добавлением глутамакса, B27 и 1% (об. / Об.) Антибиотика-антимикотика (все Gibco), а затем обрабатывали гистонами при 0, 25, 50, 100 и 200 нМ в течение следующих 24 часов. .Гибель клеток, вызванная гистонами, определяли с помощью анализа цитотоксичности CytoTox-Glo ™ (Promega). Вкратце, дегенерирующие клетки высвобождают внутриклеточные протеазы, которые расщепляют ацетиламинофлуорен (AAF) с высвобождением аминолюциферина, который является субстратом для люциферазы. Эта реакция генерирует люминесценцию, пропорциональную количеству мертвых клеток 18 , и ее измеряли с помощью люминометра Promega GloMax 96. Показания были сделаны в течение 24 часов, чтобы предотвратить ложноотрицательные результаты из-за деградации протеазы.

Анализ роста субстрата и выживаемости

Кортикальные нейроны мыши получали из E16.5 мышей CBA x C57BL / 6 использовали протокол, аналогичный крысам, за исключением того, что вместо папаина использовали расщепление 0,05% (мас. / Об.) Трипсином в течение 10 минут при 37 ° C в забуференном физиологическом растворе Хэнка (HBS, Gibco). Клетки высевали из расчета 3 × 10 3 клеток на лунку в 96-луночные планшеты в нейробазальной среде с добавлением 2% (об. / Об.) Добавки NS21, 0,25 мМ L-глутамина и 10 мкг / мл гентамицина 19 . Лунки ранее были покрыты поли-D-лизином, гистоном h2 или гистоном типа VIII-S (фракция гистона тимуса теленка, богатая аргинином, преимущественно гистон h4, Sigma).Клетки выращивали в течение 72 часов, и количество живых нейронов оценивали с помощью окрашивания ацетоксиметилового эфира кальцеина (AM). Клетки инкубировали с 1,1 нМ кальцеина AM в течение 30 мин при 37 ° C в увлажненном инкубаторе. Hoechst 33342 (16 мкМ) (Molecular Probes, Invitrogen) добавляли для контрастного окрашивания ядра как живых, так и мертвых клеток. Затем добавляли гемоглобин (15 мг / мл) для гашения флуоресценции, генерируемой культуральной средой, и изображение планшета отображали с использованием прибора для визуализации флуоресценции клеток TROPHOS Plate RUNNER HD.Общая клеточная флуоресценция кальцеина AM, мера метаболической активности живых клеток, определялась с помощью пакета анализа Tina (Trophos).

Культура кортикальных астроцитов

Кортикальные астроциты культивировали от крысят на 2–3-дневный постнатальный период. Две части коры удаляли и разрезали на мелкие кусочки (~ 2 мм 2 ) перед перевариванием 5 мл 0,2% (мас. / Об.) Трипсина, БСА, ДНКазы I (Sigma) в буфере Эрла (Уортингтон) при 37 ° C в течение 20 мин. Расщепление прекращали добавлением равного объема DMEM с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об / мин.Осадок ресуспендировали в 10 мл DMEM с 10% (об. / Об.) FCS и 1% (об. / Об.) Пенициллина и стрептомицина (Gibco), которые делили между двумя колбами по 5 мл, покрытыми поли-L-лизином ( 0,5 мг / мл Sigma). Колбы инкубировали, как описано выше, в течение 10 дней со сменой среды через 48 и 96 часов. Клетки пассировали и высевали на покровные стекла, покрытые поли-D-лизином, в течение следующих 6 дней в 4-луночных планшетах до обработки гистонами и окрашивания антителами.

Иммуногистохимия

Клетки фиксировали в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде (PFA) и инкубировали в течение 1 часа с антиглиальным кислым фибриллярным белком GFAP кроличьи поликлональные антитела (Z0334 Dako), разведенные в соотношении 1: 2500 в PBS или расщепленном каспазе. 3 (Abcam), разведенные 1: 500 в PBS.Клетки промывали и инкубировали в течение 1 часа в поликлональном антикроличьем TRITC (Dako), разведенном 1: 2500 (для GFAP), или козьем поликлональном антикроличьем поликлональном Alexa Fluor 488 (Invitrogen) для каспазы 3 в PBS перед промывкой и закреплением. Некоторые культуры нейронов инкубировали с 15 мкМ пропидия йодида (Invitrogen) в течение 10 минут перед фиксацией и с 0,5 мкМ DAPI (4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол) (Sigma) в течение 5 минут после фиксации во время промывания PBS.

Первичная культура клеток микроглии

Смешанные глиальные культуры получали из эксплантатов коры головного мозга крыс линии Вистар P3 (3-дневный постнатальный), как описано ранее 20,21 .Вкратце, после механической и химической диссоциации клетки высевали в DMEM 10% (об. / Об.) Эмбриональной бычьей сыворотки с плотностью 500000 клеток / мл и культивировали при 37 ° C в увлажненном 5% (об. / Об.) CO 2 / 95% (об. / Об.) Воздуха. Реагенты были получены от Invitrogen. Слияние смешанной глиальной культуры было достигнуто через 5 дней in vitro . Культуры осторожно встряхивали, плавающие клетки осаждали и субкультивировали. Этот метод привел к чистоте 96–99%, по оценке путем окрашивания кроличьим поликлональным антителом 1 (Iba1) антиионизированной адаптерной молекулы связывания кальция (Iba1) в концентрации 1: 1000 (019-19741, Wako Chemicals, Япония) и 4 ‘, 6-диамидино. -2-фенилиндол (DAPI).

Анализ хемотаксиса

Хемотаксис оценивали с использованием камеры Boyden 22 (Neuroprobe, Bethesda, MD). В камеру устанавливали поликарбонатные фильтры (диаметр пор 5 мкм), нижние лунки которой были заполнены бессывороточной DMEM с гистоном h2 или без него в различных концентрациях. Свежеприготовленную микроглию суспендировали в бессывороточной среде DMEM и помещали в верхние лунки по 50000 клеток / лунку. Камеру выдерживали в инкубаторе CO 2 при 37 ° C в течение 3 часов.Фильтр удаляли и окрашивали RapiDiffII (Biostain RRL, UK), клетки с верхней стороны фильтра вытирали и количество клеток, которые мигрировали на нижнюю сторону, подсчитывали, как описано в 20 . Было проведено четыре независимых эксперимента (для каждого условия в каждом эксперименте было подсчитано 4–8 фильтров), и данные были выражены в виде количества клеток.

Анализ MHC класса II

Клетки микроглии помещали на стеклянные покровные стекла из расчета примерно 50 000 клеток / лунку.На следующий день клетки оставляли в бессывороточной среде DMEM на 4 часа, а затем к среде добавляли гистон в различных концентрациях. Через двадцать четыре часа клетки фиксировали в 4% (мас. / Об.) PFA в течение 30 минут и ледяным метанолом в течение 5 минут. Микроглию метили с использованием поликлональных антител к ионизированной молекуле адаптера связывания кальция 1 (Iba1) (Wako). Для обнаружения антигенов MHC класса II мы использовали моноклональные мышиные антитела против RT1B крысы (OX-6) (клон Serotec 554926), BD Bioscience, разведенное 1: 100. Определяли процент клеток, которые были OX-6-положительными, от общего числа Iba1-положительных клеток.Были проанализированы три независимых эксперимента, каждый из которых проводили в трех повторностях. Затем культуры обрабатывали липополисахаридом (LPS) (Sigma UK) в концентрации 1 мкг / мл или гистоном h2 в концентрации 25–200 нМ в течение 24 часов. Первичные культуры микроглии инкубировали в бессывороточной среде в течение 24 часов и идентифицировали с помощью Iba1 (красный), в то время как реактивные микроглии идентифицировали с помощью OX-6, который маркирует клетки, экспрессирующие MHC-класс II, зеленым, так что дважды окрашенные клетки становятся желтыми.

Анализы выживания и смерти

Когда микроглиальные клетки хранятся в бессывороточных условиях и в относительно низкой концентрации (приблизительно 2000 клеток / мм 2 ), апоптотическая гибель клеток наблюдается в течение 24 часов 21 .Поэтому для оценки выживаемости микроглию высевали на чашки с низкой плотностью и инкубировали в течение 24 часов в бессывороточной среде с добавлением возрастающих доз гистона h2 (50, 100 и 200 нМ). Затем клетки фиксировали и иммуноокрашивали Iba1 и DAPI. Количество окрашенных Iba1 клеток подсчитывали на покровное стекло в четырех независимых экспериментах.

Возможность того, что гистон h2 индуцирует апоптоз, была проверена путем окрашивания на активированную каспазу 3 через 6 и 24 часа после нанесения гистона h2.

Статистика

Все статистические тесты проводились в Sigmaplot v.12.3 (Программное обеспечение Systat). Для проверки различий между группами использовали односторонний дисперсионный анализ или дисперсионный анализ рангов. Все апостериорные тесты проводились с соответствующей поправкой Бонферрони / Холма-Сидака. Дозозависимые зависимости были проверены с использованием линейной регрессии, где это необходимо.

Результаты

В ходе экспериментов с использованием совместных культур коллагенового геля для идентификации хемопеллентов аксонов из различных областей мозга мы наблюдали, что взрослые кортикальные эксплантаты вызывают дегенерацию эмбриональных нервных эксплантатов.Показав, что среда, кондиционированная эксплантатами мозга взрослых, также вызывает нейродегенерацию, мы приступили к использованию этой системы для выявления нейротоксической активности и продемонстрировали, что гистон-линкер h2, но не гистоны ядра, вызывает дегенерацию кортикальных нейронов. Поскольку нейродегенерация сопровождается активацией глии, а затем воспалением и активацией иммунной системы, мы исследовали, модулирует ли гистон h2 фенотип астроцитов и микроглии, а также показали, что это действительно так.

Выделение гистонов, высвобождаемых из мозга млекопитающих

При культивировании только эмбриональные эксплантаты интенсивно расширяют аксоны в течение 24–48 часов, но в присутствии близлежащего взрослого мозга начинают дегенерировать в течение 24 часов. Мы предположили, что это может быть вызвано диффундирующими гликозилированными белками или пептидами, которые по-разному связываются с лектинами. Таким образом, мы разработали анализ совместного культивирования, в котором гранулы агарозы, покрытые лектином, помещали между взрослыми и эмбриональными эксплантами, чтобы посмотреть, можно ли ингибировать дегенерацию.

Методом проб и ошибок мы обнаружили, что гранулы Sambucus nigra с лектиновым покрытием (SNA) значительно снижали или блокировали дегенерацию в совместных культурах коллагенового геля (6/6 экспериментов, рис. 1). Поэтому мы использовали покрытые SNA шарики для создания колонок для аффинной хроматографии для адсорбции гликозилированных фрагментов, которые затем можно было выделить.

Рисунок 1. Опосредованная диффузией дегенерация неокортекса взрослого человека ингибируется лектином

Sambucus nigra .

( a ) показывает взрослый кортикальный эксплантат слева (AD) и дегенерирующий эмбриональный кортикальный эксплантат E 15 (E) справа; стрелки указывают пузырьки дегенерирующих аксонов. ( b ) Дегенерацию ингибируют помещением гранул агарозы, покрытых лектином Sambucus nigra , между эксплантами.

После SDS-PAGE элюатов колонки с помощью MALDI TOF / TOF / QTOF анализа были идентифицированы различные белки, включая малатдегидрогеназу 1, лактатдегидрогеназу A, фактор компонента комплемента h, каппа-цепь C Ig, убиквитин-конъюгированный фермент E2N. , простагландин D-синтаза, простагландин D2, белок-предшественник серотрансферрина, белок-переносчик гликолипидов, трансферрин, аполипопротеин A, аполипопротеин E и гистоны, h3A, h3B и h4.

Продемонстрировав присутствие гистонов в колонке, мы обнаружили с помощью вестерн-блоттинга, что гистоны h2 и h3B присутствовали в среде, кондиционированной взрослым мозгом (рис. 2).

Рис. 2. Высвобождение гистонов h2 и h3B из ишемизированного мозга взрослого человека.

Кондиционированная среда для взрослых (ACM) была приготовлена ​​путем инкубации ишемических срезов мозга в определенной культуральной среде, которую подвергали аффинной хроматографии. Вестерн-блоттинг с использованием антител, специфичных к гистонам h2 и h3B, показывает присутствие гистона h2 при 32 кДа (дорожка 1) и гистона h3B при 16 кДа в ACM (дорожка 3).Стандарты белков показаны при 32 кДа (полоса 2 h2), 16 кДа для мономера и 32 кДа для димера (полоса 4 h3B).

Гистон h2, но не гистоны ядра, нейротоксичен

Диссоциированные эмбриональные нейроны коры головного мозга культивировали в течение 48 часов, а затем еще 24 часа в присутствии гистонов h2, h3A, h3B, h4 и h5. Только гистон h2 продемонстрировал нейротоксичность при концентрациях ниже 200 нМ (Рисунок 3 – Рисунок 5). Гистон h2 вызывал значительную дегенерацию от 100 нМ (ANOVA по рангам p <0.001), а зависимость от дозы очевидна между 0 и 200 нМ (R 2 = 0,966, n = 6, p <0,001).

Рис. 3. Линкер гистона h2 нейротоксичен.

Диссоциированные нейроны коры культивировали в течение 48 часов, а гистоны применяли еще в течение 24 часов. Гибель клеток определяли по люминесценции для измерения высвобождения протеазы и выражали в относительных единицах люминесценции (RLU). Для ясности средние значения RLU выражены как +/- 2 x стандартное отклонение (SD). Гистон h2 вызывал дозозависимую гибель нейронов коры ( a ), в то время как коровые гистоны h3A, h3B, h4 и h5 не имели эффекта до 200 нМ ( b – e ).Гибель клеток, измеренная по люминесценции, была подтверждена непосредственно с помощью фазово-контрастной микроскопии диссоциированных кортикальных нейронов в культуре (рис. 4).

Рис. 4. Нейротоксические эффекты гистона h2 на диссоциированные нейроны коры.

Кортикальные нейроны помещали на покровные стекла, покрытые ламинином, на 48 часов. Культуры обрабатывали гистоном h2 в концентрации 50, 100 или 200 нМ или оставляли в качестве контроля еще на 24 часа, когда их инкубировали с иодидом пропидия (PI) в течение 10 минут перед фиксацией и инкубацией с DAPI.Когда иодид пропидия проникает в умирающие клетки и связывается с ядерной ДНК, его красная флуоресценция значительно усиливается. Вверху слева (контроль) и внизу слева (100 нМ гистон h2) показаны примеры с яркой фазой с соответствующими объединенными изображениями DAPI (синий) и PI (красный), которые указывают количество умирающих клеток (пурпурный) и общее количество ядер (пурпурный и синий). .

Рисунок 5. Гистон h2 индуцирует апоптоз.

Кортикальные нейроны помещали на покровные стекла, покрытые ламинином, и обрабатывали гистоном h2 при 50, 100 и 200 нМ в течение 6 часов и 24 часов.Клетки фиксировали и окрашивали DAPI (все ядра) и активированной каспазой 3 для обнаружения апоптоза. Подсчет как для DAPI, так и для каспазы 3 был сделан для 11–14 случайных полей на покровное стекло для каждого условия с использованием изображения J (Калифорнийский университет в Сан-Франциско, UCSF) и выражен как% каспазы 3 / DAPI. Гистон h2 индуцировал значительную повышающую регуляцию активированной каспазы 3 через 6 и 24 часа для нейронов, обработанных при 100 и 200 нМ соответственно (ANOVA).

Гибель клеток определяли по высвобождению протеазы и выражали в относительных единицах люминесценции (RLU).Это было подтверждено на микроскопическом уровне и с использованием витального красителя иодида пропидия (который поглощается только умирающими клетками при разрушении их мембран) и DAPI, который окрашивает все ядра как в живых, так и в умирающих клетках.

Мы рассмотрели возможность того, что презентация гистонов может быть решающим фактором их действия, и исследовали эффекты связанных с субстратом гистонов на выживаемость нейронов. Однако при связывании с чашкой гистон h2 и поли-D-лизин значительно увеличивали выживаемость нейронов по сравнению с контролями, тогда как гистон h4 не оказывал эффекта (фиг. 6).

Рисунок 6. Влияние гистонов, представленных в субстрате, на выживаемость нейронов.

Диссоциированные нейроны высевали на субстрат, образованный связыванием гистона h2, гистона h4 и поли-D лизина с культуральными чашками при 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг / мл. Рост на иммобилизованном гистоне h2 и поли-D-лизине значительно увеличивался при 5 и 10 мкг / мл (однофакторный дисперсионный анализ с апостериорной коррекцией Бонферрони), но не зависел от уровней гистона h4 в субстрате.

Гистон h2 индуцирует глиальную реактивность

Хорошо известно, что глиальные клетки могут пролиферировать и активироваться в регионах, где нейроны дегенерируют, поэтому мы провели предварительные качественные наблюдения за эффектами гистона h2 на кортикальных астроцитах. Контрольные культуры в основном демонстрируют плоскую морфологию «типа 1», а не звездчатую «тип 2». Гистон h2 значительно увеличивает количество астроцитов звездчатой ​​морфологии при применении в концентрациях всего 15 нМ (рис. 7). Эти наблюдения согласуются с предыдущим отчетом 23 , и мы продолжили изучать эффекты гистона h2 на микроглию, которые опосредуют врожденный иммунный ответ центральной нервной системы (ЦНС).

Рис. 7. Гистон h2 способствует дифференцировке астроцитов.

Гистон h2, нанесенный в течение 24 часов при 50 нМ на 6-дневные культивированные кортикальные астроциты (визуализированные с использованием антител к GFAP), способствовал дифференцировке звездчатых (тип 2) по сравнению с плоскими (тип 1) морфологиями.

Гистон h2 активирует экспрессию MHC класса II в микроглии

Клетки микроглии представляют собой резидентные моноциты в ЦНС, и локальное повреждение побуждает их принимать эффекторное или «активированное» состояние, которое связано с развитием амебоидной морфологии, провоспалительная экспрессия цитокинов и экспрессия антигенов MHC класса II 20 . Сначала мы рассмотрели экспрессию MHC класса II с использованием OX-6 в качестве маркера после применения гистона h2 (рис. 8a, b) или LPS (рис. 8b). Около 10% необработанной микроглии были OX-6-положительными, но этот показатель увеличился до 58%, когда клетки обрабатывали гистоном h2 в дозе 25 нМ, и вырос почти до 80% с увеличением доз, так что эффект 50 нМ гистона h2 не отличался от дозировки. ЛПС, который вызывает максимальный ответ (8a и b).

Фигура 8. Гистон 1 усиливает экспрессию MHC класса II в микроглии.

( a ) Первичные культуры микроглии инкубировали в бессывороточной среде в течение 24 часов и идентифицировали с помощью Iba1 (красный). ( b ) Затем культуры обрабатывали гистоном h2 (100 нМ) в течение 24 часов. Активированная микроглия была идентифицирована с помощью OX-6 (который маркирует MHC-class II, зеленый), так что дважды окрашенные клетки выглядят желтыми. Масштабные линейки: 100 мкм. ( c ) Гистон h2 дозозависимо увеличивал экспрессию MHC класса II до уровня, аналогичного тому, который вызывается LPS (1 мкг / мл). 25 нМ h2 вызывали 6-кратное увеличение экспрессии OX-6 (p <0,001), тогда как эффекты 50 нМ гистона h2 не отличались от максимального ответа на LPS при 1 мкг / мл. Планки погрешностей представляют собой ± SEM для всех условий, односторонний дисперсионный анализ, апостериорная коррекция Бонферрони.

Гистон h2 — мощный хемоаттрактант для микроглии

Микроглия мигрирует к участкам повреждения ЦНС, которые высвобождают хемоаттрактанты. Используя камеру Бойдена, в которой микроглия мигрирует вверх по градиенту концентрации аттрактанта через поры в поликарбонатном фильтре, гистон h2 значительно увеличивает хемотаксис в зависимости от дозы (рис. 9a и b).

Рис. 9. Гистон h2 индуцирует хемотаксис микроглии.

( a и b ) Хемотаксис в отношении гистона h2 измеряли с использованием анализа камеры Бойдена, и клетки, которые мигрировали через фильтр, помечены синим цветом. Добавление гистона h2 в нижнюю лунку камеры ( b ) увеличивало миграцию микроглии на поверхность внутренней мембраны по сравнению с контролем ( a ), демонстрируя, что гистон h2 является сильным хемоаттрактантом для микроглии. Увеличение миграции микроглии, вызванное гистоном h2, было значительным (p <0,007 при 50 нМ, p <0,001 при 100 и 200 нМ, однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, posthoc-коррекция Холма-Сидака). Планки погрешностей представляют ± SEM.

Гистон h2 способствует выживанию микроглии

Клетки микроглии инкубировали при низкой концентрации в бессывороточной среде в течение 24 часов для оценки выживаемости. Предыдущая работа показывает, что депривация сыворотки приводит к потере около 50% микроглиальных клеток к 24 часам 21 . Мы количественно определили количество клеток после 24 часов инкубации в бессывороточной среде, зафиксировав их и иммуноокрашив Iba1.Для микроглии, обработанной гистоном h2 при 50 и 200 нМ, выживаемость была значительно увеличена, но не было усиленного эффекта гистона h2 при увеличении дозы, что подтверждает, что в диапазоне, в котором он высокотоксичен для нейронов, он оказывает противоположное действие на микроглию (рис. ). Нам не удалось различить увеличение продолжительности жизни и пролиферацию, но эксперименты проводились в условиях, которые приводят к потере клеток, и кажется наиболее вероятным, что увеличенное количество клеток, остающихся после 24 часов в культуре, связано с улучшением выживаемости, а не с увеличением пролиферации.

Фиг.10. Влияние гистона h2 на выживаемость микроглии.

Обработка гистоном h2 увеличивала выживаемость микроглии во всех группах лечения, рассматриваемых вместе (ANOVA p = 0,011, апостериорная коррекция Холма-Сидака), а при множественных сравнениях выживаемость была значительно увеличена как при 50 нМ, так и при 200 нМ h2 по сравнению с контролем, но просто не удалось для достижения значимости при 10 нМ (p = 0,06).

Рис. 11. Гистон h2 запускает нейровоспаление через петлю положительной обратной связи.

Гистон h2, высвобождаемый умирающими нейронами, вызывает гибель клеток соседних нейронов и одновременно способствует провоспалительным ответам в микроглии и астроцитах, которые затем могут усугубить нейродегенерацию.

Обсуждение

Гистон h2 управляет нейродегенерацией и активацией микроглии

Мы показываем, что гистон h2 высвобождается из поврежденных эксплантатов мозга и вызывает гибель нейронов и активацию врожденного иммунного ответа через микроглию. Линкерный гистон h2 вызывал дозозависимую гибель кортикальных нейронов, но коровые гистоны h3A, h3B, h4 и h5 не оказывали эффекта до 200 нМ. Таким образом, действие гистона h2 является избирательным и свидетельствует против гистон-индуцированной нейродегенерации, вызванной разрушением мембран из-за их очень основной природы.Действительно, гистон h2 не убивает астроциты и микроглию, но заставляет их становиться реактивными. Эта дифференциальная токсичность отличается от той, что наблюдается при сепсисе, где гистоны h4 и h5, а не гистон h2 являются медиаторами гибели эндотелиальных клеток 13 , и от агрегации тромбоцитов, где гистон h5 является активатором 14 .

Мы показали высвобождение гистонов h3A, h3B и h4 из мозга взрослого человека путем секвенирования и высвобождение гистонов h2 и h3B посредством вестерн-блоттинга. Таким образом, эти наблюдения согласуются с предыдущими сообщениями о внеклеточном высвобождении гистонов 1,7 и усиливают представление о том, что появление гистонов во внеклеточном пространстве может быть связано с патофизиологическими эффектами в соседних клетках.

Было показано, что гистон h2 напрямую связывается с полисиаловой кислотой и способствует выживанию первичных сенсорных нейронов 23 , эффект противоположен описанному здесь для растворимого гистона h2. Однако при иммобилизации на пластиковом гистоне h2 культуры ткани, но не на h4, он значительно увеличивает выживаемость нейронов дозозависимым образом и согласуется с эффектами, о которых сообщается на сенсорные афференты, подразумевая, что связывание с полисиаловой кислотой или пластиком маскирует нейротоксическое связывание с клеточной поверхностью. или предотвращает интернализацию.

Мы выделили гистоны с использованием лектина Sambucus nigra , который связывает сиалированные гликопротеины посредством распознавания последовательностей Neu5Ac (α2–6) Gal / GalNAc и имеет особенно высокое сродство к N-ацетилнейраминовой кислоте, связанной α2,6-связями с галактозой или N -ацетилгалактозамин. О гистонах не сообщалось о сиалилировании, и возможно, что мы совместно очищали гистоны, связанные с сиалированными фрагментами, от которых они диссоциировали бы в восстанавливающих условиях SDS PAGE.

Гистон h2 активирует врожденный иммунитет через микроглию

Мы показали, что низкие дозы гистона h2 резко повышают экспрессию антигенов MHC класса II, которые представляют полученные от патогенов фрагменты CD4 + T «хелперным» клеткам.Таким образом, когда гистон h2 высвобождается из умирающей или поврежденной нервной системы, он вызывает воспалительную реакцию через врожденную иммунную систему. Мы также впервые показываем, что гистон h2 является мощным хемоаттрактантом для микроглии, которая рекрутируется хемокинами в места воспаления и инфекции. Гистон h2 также способствует выживанию микроглии в условиях стресса, и вместе взятые эти данные согласуются с новым вкладом внеклеточного гистона h2 в врожденный иммунитет в защиту нервной системы.Переход микроглии из состояния «обследования» (также называемого покоем) в провоспалительное или «эффекторное» состояние широко рассматривается как палка о двух концах 24–26 в поврежденной нервной системе, и теперь можно предположить, что что эффекты гистона h2 могут способствовать этому.

Возможные механизмы накопления и токсичности внеклеточных гистонов

Мало что известно о механизмах или обстоятельствах, при которых гистон h2 появляется во внеклеточном пространстве, хотя основные гистоны наблюдались в экзосомах 27 .Возможно, существуют механизмы выведения гистонов после гибели клеток или апоптоза, но при определенных условиях они становятся перегруженными. Известно, что повышающая регуляция гистонов происходит при AD, где эктопический неядерный h2 обнаруживается на поверхности нейрональных клеток и в активированных астроцитах 28 . Фосфорилированный гистон h4 является ядерным маркером для M-фазы нормального деления клеток, но становится активированным и повторно локализуется в цитоплазме нейронов в AD 29 . Имеются убедительные доказательства того, что аберрантный повторный вход в клеточный цикл может быть значительной причиной гибели нейрональных клеток в AD 30 .Более того, после УФ-индуцированного повреждения изоформа гистона h2. 2 перемещается из ядра в цитоплазму и запускает апоптоз 10 . Таким образом, одним источником внеклеточных гистонов, включая гистон h2 10,31 , могут быть те, которые повторно локализованы в цитоплазме, тогда как другим источником могут быть те, которые высвобождаются из распадающихся ядер. Потенциально внеклеточные гистоны могут действовать как на поверхности клетки, так и в цитоплазме после поглощения. Следовательно, накопление внеклеточных гистонов может усугубить нейротоксичность и по мере увеличения гибели клеток вызвать автокаталитический каскад гибели нейрональных клеток.Гистоны также участвуют в образовании нерастворимых белковых отложений. Они связываются с ассоциированным с болезнью Паркинсона белком α-синуклеином и увеличивают скорость его фибрилляции 32–34 . Гистоны также связывают белок-предшественник β-амилоида Альцгеймера (APP) и β-амилоид с высоким сродством 32,35 . Поскольку гистоны обнаруживаются в амилоидных бляшках в головном мозге AD 36 , увеличение их экспрессии может быть катализатором гибели нейронов и согласуется с данными о повышенных титрах антигистоновых антител 12 .

Под воздействием холодового стресса срезы коркового слоя теряют способность увеличивать дыхание в ответ на электрическую стимуляцию 37,38 . Это угнетение дыхания сопровождается миграцией гистонов из ядра в цитоплазму, где они связываются с микросомами и митохондриями, которые набухают. Угнетение дыхания, скорее всего, является результатом ингибирования окислительного метаболизма АТФ и воспроизводится путем добавления растворимых гистонов в культуральную среду. Таким образом, при определенных условиях гистоны могут высвобождаться из ядра и захватываться обоими событиями, ведущими к нейрональной токсичности.Эти ранние наблюдения точно отражают те, которые наблюдались после УФ-индуцированного повреждения, когда гистон h2.2 перемещается из ядра в митохондрии через цитоплазму и запускает апоптоз 10 . Примечательно, что было показано, что в то время как линкерные и коровые гистоны связываются с митохондриями и высвобождают проапоптотические белки, только линкерный гистон h2. 2 разрушает потенциал внутренней мембраны и вызывает высвобождение митохондриального пула NAD + 39 . Наше наблюдение, что гистон h2 вызывает апоптоз через активированную каспазу 3, полностью согласуется с наблюдениями митохондриального повреждения и дисфункции.

Сообщалось о свободных гистонах в крови 13,40 , и разумно ожидать, что их уровни будут увеличиваться, как и уровни нуклеосом, после гибели нейрональных клеток по любой причине. Уже давно известно, что гистоны могут быть цитотоксичными для различных бактерий и клеток млекопитающих 13,41–43 . Гистоны могут способствовать защите от бактериальных и вирусных инфекций, действуя как рецепторы клеточной поверхности для бактериальных и вирусных белков и как противомикробные агенты в кишечнике.Внеклеточные гистоны и гистоновые пептиды (например, ncamp-1, Hipposin, Onchorynciin II, Parasin I, Buforin I / II, MUMP1-3) являются неспецифическими антимикробными агентами иммунного ответа у рыб, амфибий и млекопитающих 42,44–55 . Гистоны в крови захватывают патогены, когда нейтрофилы высвобождают пакеты гранулярных белков и хроматина, известные как «внеклеточные ловушки нейтрофилов», которые связывают бактерии, грибы и дрожжи как часть врожденного иммунного ответа 56–58 . Однако, как обсуждалось, возможно, что вклад гистона h2 в иммунную защиту нервной системы на самом деле является разрушительным.

Мы предполагаем, что при нейродегенеративных заболеваниях и после травм гистон h2 действует в головном мозге как антимикробный пептид, который управляет врожденной иммунной системой и нацелен на нейроны как на инородные тела. Мы предполагаем, что гистоны распознают сайты связывания в нервной системе, которые являются общими с сайтами бактерий и вирусов, и что митохондрии, которые эволюционно произошли от бактерий, являются первичными внутриклеточными мишенями гистона h2 в нервной системе.

Вклад авторов

AP задумал исследование, провел эксперименты с коллагеновым гелем, подсчет клеток; интерпретация и развитие результатов и написал статью. AL принимал участие в интерпретации и разработке результатов и редактировал документ. JG провел эксперименты с нейронами, интерпретировал и развил результаты и отредактировал статью. FO выполнил анализ нейронов, культур астроцитов и люциферазы и отредактировал статью. JN выполнил выделение и очистку белка. DB и MC выполнили анализ микроглии и отредактировали статью. Все авторы одобрили окончательный вариант рукописи.

Конкурирующие доли

Конкурирующие доли участия не были раскрыты.

Информация о гранте

Эта работа была поддержана грантами проектов MRC и BBSRC для AP и грантом программы MRC для AL (G0601064).

Благодарности

Мне очень приятно поблагодарить Гранта Рэя за ИТ-поддержку, Сэма Барнса за статистический анализ, Энтони Грэма за антитело к каспазе 3, а также Джеффа Кука и Кэролайн Формстоун за полезные обсуждения. Анализ последовательности был выполнен Ником Тотти и Сарой Ханрахан в лаборатории анализа белков Лондонского исследовательского института, Cancer Research UK London WC2A 3PX.

Рекомендуется F1000

Ссылки

  • 1. Парсегиан М.Х., Лурс К.А.: За стенками ядра: роль гистонов в передаче сигналов клеток и врожденном иммунитете. Biochem Cell Biol. 2006; 84 (4): 589–604. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 2. Болтон SJ, Перри VH: Histone h2; нейронный белок, связывающий бактериальный липополисахарид. J Neurocytol. 1997; 26 (12): 823–31. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 3.Brix K, Summa W., Lottspeich F, et al. : Внеклеточный гистон h2 опосредует связывание тиреоглобулина с клеточной поверхностью макрофагов мыши. J Clin Invest. 1998; 102 (2): 283–93. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 4. Hefeneider SH, Cornell KA, Brown LE, et al. : Нуклеосомы и ДНК связываются со специфическими молекулами клеточной поверхности мышиных клеток и индуцируют продукцию цитокинов. Clin Immunol Immunopathol. 1992; 63 (3): 245–51. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 5. Уотсон К., Эдвардс Р.Дж., Шаунак С., и др. : внеядерное расположение гистонов в активированных лимфоцитах периферической крови человека и культивируемых Т-клетках. Biochem Pharmacol. 1995; 50 (3): 299–309. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 6. Watson K, Gooderham NJ, Davies DS, et al. : Нуклеосомы связываются с протеогликанами клеточной поверхности. J Biol Chem. 1999; 274 (31): 21707–13. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 7. Габлер Ч., Бланк Н., Иеронимус Т., и др. : Экстраядерное обнаружение гистонов и нуклеосом в активированных лимфобластах человека как раннее событие апоптоза. Ann Rheum Dis. 2004; 63 (9): 1135–44. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 8. Габлер К., Калден Дж. Р., Лоренц Х. М.: Предполагаемая роль модифицированных апоптозом гистонов в индукции аутоиммунитета при системной красной волчанке. Biochem Pharmacol. 2003; 66 (8): 1441–6. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 9. Белл Д.А., Моррисон Б.: Спонтанная апоптотическая гибель нормальных лимфоцитов человека in vitro : высвобождение и иммунопролиферативный ответ на нуклеосомы in vitro . Clin Immunol Immunopathol. 1991; 60 (1): 13–26. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 10. Кониси А., Симидзу С., Хирота Дж., и др.: Участие гистона h2.2 в апоптозе, индуцированном двухцепочечными разрывами ДНК. Cell. 2003; 114 (6): 673–88. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 11. Ву Д., Инграм А., Лахти Дж. Х., и др. : Апоптотическое высвобождение гистонов из нуклеосом. J Biol Chem. 2002; 277 (14): 12001–8. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 12. Mecocci P, Ekman R, Parnetti L, et al. : Аутоантитела к антигистону и анти-дцДНК при болезни Альцгеймера и сосудистой деменции. Biol Psychiatry. 1993; 34 (6): 380–5. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 13. Xu J, Zhang X, Pelayo R, et al. : Внеклеточные гистоны являются основными медиаторами смерти при сепсисе. Nat Med. 2009; 15 (11): 1318–21. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 14. Fuchs TA, Bhandari AA, Wagner DD: Гистоны вызывают быструю и глубокую тромбоцитопению у мышей. Кровь. 2011; 118 (13): 3708–14.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 15. Ламсден А.Г., Дэвис А.М.: Самые ранние сенсорные нервные волокна направляются к периферическим целям с помощью аттрактантов, отличных от фактора роста нервов. Природа. 1983; 306 (5945): 786–8. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 16. Пини А: Хеморепульсия аксонов в развивающейся центральной нервной системе млекопитающих. Наука. 1993; 261 (5117): 95–8. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 17. Laemmli UK: Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага Т4. Природа. 1970; 227 (5259): 680–5. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 18. Чо М.Х., Найлз А., Хуанг Р., и др. : Биолюминесцентный анализ цитотоксичности для оценки целостности мембраны с использованием протеолитического биомаркера. Toxicol In vitro. 2008; 22 (4): 1099–106. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 19.Чен Ю., Стивенс Б., Чанг Дж., и др. : NS21: новое определение и модифицированная добавка B27 для культур нейронов. J Neurosci Methods. 2008; 171 (2): 239–47. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 20. Кальво М., Чжу Н., Цантулас С., и др. : Передача сигналов Neuregulin-ErbB способствует пролиферации микроглии и хемотаксису, что способствует микроглиозу и боли после повреждения периферического нерва. J Neurosci. 2010; 30 (15): 5437–50. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 21. Кояма Y, Кимура Y, Yoshioka Y, et al. : депривация сыворотки вызывает гибель клеток культивируемой микроглии крысы, сопровождаемую экспрессией белка Bax. Jpn J Pharmacol. 2000; 83 (4): 351–4. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 22. Boyden S: Хемотаксический эффект смесей антител и антигена на полиморфно-ядерные лейкоциты. J Exp Med. 1962; 115 (3): 453–66.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 23. Мишра Б., фон дер Охе М., Шульце С., и др. : Функциональная роль взаимодействия между полисиаловой кислотой и внеклеточным гистоном h2. J Neurosci. 2010; 30 (37): 12400–13. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 24. Block ML, Zecca L, Hong JS: Microglia-обусловленная нейротоксичность: раскрытие молекулярных механизмов. Nat Rev Neurosci. 2007; 8 (1): 57–69.PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 25. Гриффин В.С., Баргер С.В.: Нейровоспалительные цитокины — общая нить в патогенезе болезни Альцгеймера. US Neurol. 2010; 6 (2): 19–27. PubMed Аннотация | Free Full Text
  • 26. Рогов А.Д., Цирка С.Е.: Нейротоксические реакции микроглии, вызванные эксайтотоксическим повреждением в гиппокампе мыши. Curr Biol. 1998; 8 (1): 19–25. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 27. Thery C, Boussac M, Véron P, et al.: протеомный анализ экзосом, происходящих из дендритных клеток: секретируемый субклеточный компартмент, отличный от апоптотических везикул. J Immunol. 2001; 166 (12): 7309–18. PubMed Abstract
  • 28. Bolton SJ, Russelakis-Carneiro M, Betmouni S, et al. : неядерный гистон h2 активируется в нейронах и астроцитах при прионной болезни и болезни Альцгеймера, но не при острой нейродегенерации. Neuropathol Appl Neurobiol. 1999; 25 (5): 425–32.PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 29. Ogawa O, Zhu X, Lee HG, et al. : Эктопическая локализация фосфорилированного гистона h4 при болезни Альцгеймера: митотическая катастрофа ?. Acta Neuropathol (Berl). 2003; 105 (5): 524–8. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 30. Неве Р.Л., Макфи Д.Л.: Клеточный цикл как терапевтическая мишень для болезни Альцгеймера. Pharmacol Ther. 2006; 111 (1): 99–113. PubMed Реферат
  • 31.Gine E, Crespo M, Muntañola A, et al. : Индукция цитозольного высвобождения гистона h2.2 в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза после генотоксической и негенотоксической обработки. Haematologica. 2008; 93 (1): 75–82. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 32. Duce JA, Smith DP, Blake RE, et al. : Линкерный гистон h2 связывается с амилоидоподобными фибриллами, ассоциированными с заболеванием. J Mol Biol. 2006; 361 (3): 493–505. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 33.Goers J, Manning-Bog AB, McCormack AL, et al. : Ядерная локализация альфа-синуклеина и его взаимодействие с гистонами. Биохимия. 2003; 42 (28): 8465–71. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 34. Контопулос Э., Парвин Дж. Д., Фини МБ: Альфа-синуклеин действует в ядре, ингибируя ацетилирование гистонов и способствуя нейротоксичности. Hum Mol Genet. 2006; 15 (20): 3012–23. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 35.Potempska A, Ramakrishna N, Wisniewski HM, et al. : Взаимодействие между предшественником бета-амилоидного пептида и гистонами. Arch Biochem Biophys. 1993; 304 (2): 448–53. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 36. Issidorides MR, Chrysanthou-Piterou M, Kriho V, et al. : Гистоны являются компонентами сенильных бляшек при болезни Альцгеймера. Биологическая психиатрия. 1995; 37 (9): 643–643. Издатель Полный текст
  • 37.McIlwain H: Взаимодействие с белками и метаболический ответ на стимулирующие агенты в изолированных тканях головного мозга: гистоны как ингибиторы. Biochem J. 1959; 73 (3): 514–21. PubMed Аннотация | Free Full Text
  • 38. Вулф Л.С., Макилвейн И.Х .: Миграция гистонов из ядер изолированных церебральных тканей, хранящихся в холодной среде. Biochem J. 1961; 78 : 33–40. PubMed Аннотация | Бесплатный полный текст
  • 39. Cascone A, Bruelle C, Lindholm D, et al.: Дестабилизация внешней и внутренней митохондриальных мембран ядерными и линкерными гистонами. PLoS One. 2012; 7 (4): e35357. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Free Full Text
  • 40. Waga S, Tan EM, Rubin RL: Идентификация и выделение растворимых гистонов из коровьего молока и сыворотки. Biochem J. 1987; 244 (3): 675–82. PubMed Аннотация | Free Full Text
  • 41. Альстрём Л, фон Эйлер Х: Токсическое действие гистонов и протаминов тимуса. Арк Кеми Минерал оч Геол. 1946; 23А (3).
  • 42. Hirsch JG: Бактерицидное действие гистонов. J Exp Med. 1958; 108 (6): 925–44. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 43. Миллер Б.Ф., Абрамс Р., Дорфман А., и др. : Антибактериальные свойства протамина и гистона. Наука. 1942; 96 (2497): 428–430. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 44. Birkemo GA, Lüders T., Andersen Ø, et al.: Гиппосин, антимикробный пептид на основе гистонов атлантического палтуса (Hippoglossus hippoglossus L.). Biochim Biophys Acta. 2003; 1646 (1-2): 207-15. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 45. Evans DL, Kaur H, Leary J 3rd, et al. : Молекулярная характеристика нового белка распознавания образов из неспецифических цитотоксических клеток: анализ последовательности, филогенетические сравнения и антимикробная активность рекомбинантного гомолога. Dev Comp Immunol. 2005; 29 (12): 1049–64. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 46. Fernandes JM, Molle G, Kemp GD, et al. : Выделение и характеристика онкоринцина II, антимикробного пептида, полученного из гистона h2, из кожных выделений радужной форели, Oncorhynchus mykiss. Dev Comp Immunol. 2004; 28 (2): 127–38. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 47. Hiemstra PS, Eisenhauer PB, Harwig SS, et al. : Антимикробные белки макрофагов мыши. Infect Immun. 1993; 61 (7): 3038–46. PubMed Аннотация | Бесплатный полный текст
  • 48. Kim HS, Cho JH, Park HW, et al. : нейтрализующие эндотоксины антимикробные белки плаценты человека. J Immunol. 2002; 168 (5): 2356–64. PubMed Abstract
  • 49. Kim HS, Park CB, Kim MS, et al. : клонирование кДНК и характеристика буфорина I антимикробного пептида: продукта расщепления гистона h3A. Biochem Biophys Res Commun. 1996; 229 (2): 381–7. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 50. Парк С.Б., Ким Х.С., Ким С.К .: Механизм действия антимикробного пептида буфорина II. Буфорин II убивает микроорганизмы, проникая через клеточную мембрану и подавляя клеточные функции. Biochem Biophys Res Commun. 1998; 244 (1): 253–7. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 51. Парк CB, Ким М.С., Ким С.К .: Новый противомикробный пептид от Bufo bufo gargarizans. Biochem Biophys Res Commun. 1996; 218 (1): 408–13. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 52. Park IY, Park CB, Kim MS, et al. : Паразин I — антимикробный пептид, полученный из гистона h3A у сома Parasilurus asotus. FEBS Lett. 1998; 437 (3): 258–62. PubMed Abstract
  • 53. Richards RC, O’Neil DB, Thibault P, et al. : Гистон h2: антимикробный белок атлантического лосося (Salmo salar). Biochem Biophys Res Commun. 2001; 284 (3): 549–55. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 54. Rose FR, Bailey K, Keyte JW, et al. : Потенциальная роль белков гистона h2, полученных из эпителиальных клеток, во врожденной противомикробной защите в желудочно-кишечном тракте человека. Infect Immun. 1998; 66 (7): 3255–63. PubMed Аннотация | Бесплатный полный текст
  • 55. Тамура М., Натори К., Кобаяши М., et al. : Ингибирование прикрепления вирионов вируса Норуолк к клеткам млекопитающих молекулами растворимых гистонов. Arch Virol. 2003; 148 (9): 1659–70. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст
  • 56. Бринкманн В., Райхард У., Гусманн С., и др. : Внеклеточные ловушки нейтрофилов убивают бактерии. Наука. 2004; 303 (5663): 1532–5. PubMed Аннотация | Publisher Full Text
  • 57. Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, et al. : Новая программа гибели клеток приводит к внеклеточным ловушкам нейтрофилов. J Cell Biol. 2007; 176 (2): 231–41.PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Бесплатный полный текст
  • 58. Saffarzadeh M, Juenemann C, Queisser MA, et al. : Внеклеточные ловушки нейтрофилов напрямую вызывают гибель эпителиальных и эндотелиальных клеток: преобладающая роль гистонов. PLoS One. 2012; 7 (2): e32366. PubMed Аннотация | Издатель Полный текст | Полный текст бесплатно

Страница не найдена | Prysmian Group

НАСТОЯЩИЙ ВЕБ-САЙТ (И СОДЕРЖАЩАЯСЯ ЗДЕСЬ ИНФОРМАЦИЯ) НЕ СОДЕРЖИТ И НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ПРЕДЛОЖЕНИЕМ НА ПРОДАЖУ ЦЕННЫХ БУМАГ ИЛИ ПРЕДЛОЖЕНИЯ НА ПОКУПКУ ИЛИ ПОДПИСКУ НА ЦЕННЫЕ БУМАГИ В СОЕДИНЕННЫХ ШТАТАХ, АВСТРАЛИИ, КАНАДЕ ИЛИ ЯПОНИИ ПРЕДЛОЖЕНИЕ ИЛИ ЗАЯВЛЕНИЕ ТРЕБУЕТ РАЗРЕШЕНИЯ МЕСТНЫХ ОРГАНОВ, ИНАЧЕ БУДЕТ НЕЗАКОННЫМ (« ДРУГИЕ СТРАНЫ, »).ЛЮБЫЕ ПУБЛИЧНЫЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ БУДУТ ПРОВОДИТЬСЯ В ИТАЛИИ В СООТВЕТСТВИИ С ПЕРСПЕКТИВОМ, ДОЛГО РАЗРЕШЕННЫМ CONSOB В СООТВЕТСТВИИ С ДЕЙСТВУЮЩИМИ НОРМАМИ. ЦЕННЫЕ БУМАГИ, УКАЗАННЫЕ ЗДЕСЬ, НЕ БЫЛИ ЗАРЕГИСТРИРОВАНЫ И НЕ БУДУТ ЗАРЕГИСТРИРОВАНЫ В СОЕДИНЕННЫХ ШТАТАХ В соответствии с Законом США о ценных бумагах 1933 года с внесенными в него поправками («Закон О ценных бумагах») ИЛИ В СООТВЕТСТВИИ С СООТВЕТСТВУЮЩИМ ДЕЙСТВУЮЩИМ ПОЛОЖЕНИЯМ СТРАН И НЕ МОГУТ ПРЕДЛОЖИТЬСЯ ИЛИ ПРОДАТЬ В СОЕДИНЕННЫХ ШТАТАХ ИЛИ «U. S. PERSONS », ЕСЛИ ТАКИЕ ЦЕННЫЕ БУМАГИ НЕ ЗАРЕГИСТРИРОВАНЫ В соответствии с Законом о ценных бумагах, ИЛИ ДОСТУПНО ОСВОБОЖДЕНИЕ ОТ РЕГИСТРАЦИОННЫХ ТРЕБОВАНИЙ Закона о ценных бумагах.КОМПАНИЯ НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕНА ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ КАКОЙ-ЛИБО ЧАСТИ ПРЕДЛОЖЕНИЙ В СОЕДИНЕННЫХ ШТАТАХ.

ЛЮБОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ ЦЕННЫХ БУМАГ В ЛЮБОМ ГОСУДАРСТВЕ-ЧЛЕНЕ ЕВРОПЕЙСКОЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЗОНЫ (« EEA »), КОТОРОЕ ВЫПОЛНЯЛО ДИРЕКТИВУ ПРОЕКТА (КАЖДЫЙ, « СООТВЕТСТВУЮЩИЙ ГОСУДАРСТВО ЧЛЕНА »), БУДЕТ БЫТЬ ИЗОБРЕТЕН УТВЕРЖДЕНО КОМПЕТЕНТНЫМ ОРГАНОМ И ОПУБЛИКОВАНО В СООТВЕТСТВИИ С ДИРЕКТИВОЙ PROSPECTUS («РАЗРЕШЕННОЕ ПУБЛИЧНОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ ») И / ИЛИ ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ ИСКЛЮЧЕНИЕМ ПО ДИРЕКТИВЕ PROSPECTUS ОТ ТРЕБОВАНИЯ ДЛЯ ПУБЛИЧНОГО ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПУБЛИКАЦИИ.

СОГЛАСНО, ЛЮБОЕ ЛИЦО, ПРЕДСТАВЛЯЮЩЕЕ ИЛИ НАМЕРЕННОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ ЦЕННЫХ БУМАГ В СООТВЕТСТВУЮЩЕМУ ГОСУДАРСТВЕ-ЧЛЕНАХ, ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ РАЗРЕШЕННОГО ПУБЛИЧНОГО ПРЕДЛОЖЕНИЯ, МОЖЕТ СДЕЛАТЬ ЭТО ТОЛЬКО В ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ, В КОТОРЫХ НИКАКИЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА НЕ ВОЗНИКАЮТ ДЛЯ КОМПАНИИ ИЛИ ОБЯЗАТЕЛЬСТВ МЕНЕДЖЕРОВ ОПУБЛИКОВАТЬ ПРОЕКТ В СООТВЕТСТВИИ СО СТАТЬЕЙ 3 ДИРЕКТИВЫ ПРОЕКТА ИЛИ ДОПОЛНИТЕЛЬНО В СООТВЕТСТВИИ СО СТАТЬЕЙ 16 ДИРЕКТИВЫ ПРОЕКТА В КАЖДОМ СЛУЧАЕ В ОТНОШЕНИИ ТАКОГО ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

ВЫРАЖЕНИЕ «ДИРЕКТИВА ПРОСПЕКТА» ОЗНАЧАЕТ ДИРЕКТИВУ 2003/71 / EC (ДАННАЯ ДИРЕКТИВА И ПОПРАВКИ К НЕЙ, ВКЛЮЧАЯ ДИРЕКТИВУ 2010/73 / EC, В СТЕПЕНИ, ПРИНЯТОЙ В СООТВЕТСТВУЮЩЕМ ГОСУДАРСТВЕ-ЧЛЕНАХ, ВМЕСТЕ С ЛЮБЫМ УЧАСТНИКОМ) .ИНВЕСТОРАМ НЕ СЛЕДУЕТ ПОДПИСАТЬСЯ НА ЦЕННЫЕ БУМАГИ, УКАЗАННЫЕ В ДАННОМ ДОКУМЕНТЕ, ЗА ИСКЛЮЧЕНИЕМ ИНФОРМАЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙСЯ В ЛЮБОМ ПЕРСПЕКТИВЕ.

Подтверждение того, что сертифицирующая сторона понимает и принимает вышеуказанный отказ от ответственности.

Информация, содержащаяся в этом разделе, предназначена только для информационных целей и не предназначена и не открыта для доступа кем-либо, кто находится или постоянно проживает в США, Австралии, Канаде, Японии или в любой из других стран.Я заявляю, что я не проживаю и не проживаю в США, Австралии, Канаде, Японии или других странах, и я не являюсь «США». Лицо »(согласно Положению S Закона о ценных бумагах). Я прочитал и понял вышеуказанный отказ от ответственности. Я понимаю, что это может повлиять на мои права. Я согласен соблюдать его условия.

Questo SITO интернет (Е LE Informazioni IVI CONTENUTE) НЕ CONTIENE Н.Е. COSTITUISCE UN’OFFERTA Д.И. Vendita Д.И. Strumenti FINANZIARI О РАС SOLLECITAZIONE ДИ ДИ Acquisto Оферта О SOTTOSCRIZIONE Д.И. Strumenti FINANZIARI NEGLI Stati Uniti, в Австралии, Канаде О Giappone О В QUALSIASI ALTRO PAESE NEL QUALE L’OFFERTA O SOLLECITAZIONE DEGLI STRUMENTI FINANZIARI SAREBBERO SOGGETTE ALL’AUTORIZZAZIONE DA PARTE DI AUTORITÀ LOCALI O COMUNQUE VIETATE AI SENSI DI LEGGE (GLI « 911 ALTRI» PAESI).QUALUNQUE OFFERTA PUBBLICA SARÀ REALIZZATA В ИТАЛИИ SULLA BASE DI UN PROSPETTO, APPROVATO DA CONSOB IN CONFORMITÀ ALLA REGOLAMENTAZIONE APPLICABILE. GLI STRUMENTI FINANZIARI IVI INDICATI NON SONO STATI E NON SARANNO REGISTRATI AI SENSI DELLO US SECURITIES ACT DEL 1933, COME SUCCESSIVAMENTE MODIFICATO (IL « SECURITIES ACT »), O AI SECURITIES ACT «O AI SECURITIES ACT », O AI SENSIISPONDESPOLLE PAYNO E CRI SENSIISPOLLE PAYNO, E-CORI. ПРЕДЛОЖЕНИЕ O VENDUTI NEGLI STATI UNITI OA «США ЛИЦА »SALVO CHE I TITOLI SIANO REGISTRATI AI SENSI DEL SECURITIES ACT O IN PRESENZA DI UN’ESENZIONE DALLA REGISTRAZIONE APPLICABILE AI SENSI DEL SECURITIES ACT.NON SI INTENDE EFFETTUARE ALCUNA OFFERTA AL PUBBLICO DI TALI STRUMENTI FINANZIARI NEGLI STATI UNITI.

QUALSIASI DI Strumenti Оферта FINANZIARI В QUALSIASI Stato MEMBRO DELLO SPAZIO ECONOMICO EUROPEO ( « СМ ») CHE ABBIA RECEPITO LA DIRETTIVA PROSPETTI (CIASCUNO ООН « Stato MEMBRO RILEVANTE ») SARA EFFETTUATA SULLA БАЗА DI UN PROSPETTO APPROVATO DALL’AUTORITÀ COMPETENTE E PUBBLICATO IN CONFORMITÀ A QUANTO PREVISTO DALLA DIRETTIVA PROSPETTI (L ‘» OFFERTA PUBBLICA CONSENTITA «) E / O AI SENSI DI UN’ESENZIONE DAL REQUISITO DIRETTIVA PUBBL.

CONSEGUENTEMENTE, CHIUNQUE EFFETTUI O INTENDA EFFETTUARE UN’OFFERTA DI Strumenti FINANZIARI В UNO Stato MEMBRO RILEVANTE Диверса ДАЛЛ «Pubblica CONSENTITA Оферта» può FARLO ESCLUSIVAMENTE LADDOVE NON SIA PREVISTO ALCUN OBBLIGO PER LA Societa O UNO DEI СОВМЕСТНОЕ GLOBAL КООРДИНАТОРОВ O DEI МЕНЕДЖЕР DI PUBBLICARE RISPETTIVAMENTE UN PROSPETTO AI SENSI DELL’ARTICOLO 3 DELLA DIRETTIVA PROSPETTO O INTEGRARE UN PROSPETTO AI SENSI DELL’ARTICOLO 16 DELLA DIRETTIVA PROSPETTO, В RELAZIONE СКАЗОЧНОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ.

L’Espressione «DIRETTIVA PROSPETTI» INDICA LA DIRETTIVA 2003/71 / CE (СКАЗКА DIRETTIVA E LE RELATIVE MODIFICHE, нонче LA DIRETTIVA 2010/73 / UE, NELLA MISURA В НПИ SIA RECEPITA NELLO Stato MEMBRO RILEVANTE, UNITAMENTE QUALSIASI MISURA DI ATTUAZIONE NEL RELATIVO STATO MEMBRO). GLI INVESTITORI NON DOVREBBERO SOTTOSCRIVERE ALCUNO STRUMENTO FINANZIARIO SE NON SULLA BASE DELLE INFORMAZIONI CONTENUTE NEL RELATIVO PROSPETTO.

Conferma, который соответствует сертификату и принимает заявление об отказе от ответственности.

У меня есть документы, которые содержат информацию, представленную в разделе, посвященном окончательному ознакомлению, и не имеют прямого доступа к получению доступа ко всем лицам, которые находятся в негражданском государстве, в Австралии, Канаде или в Джаппоне или Уно дельи Алтри Паэзи. Dichiaro di non essere soggetto резидент или trovarmi negli Stati Uniti, в Австралии, Канаде или Giappone o uno degli Altri Paesi e di non essere una «лицо в США» (ai sensi della Regulation S del Securities Act).